肖遵強(qiáng)　黃靜　于茜　張孔亮　熊超杰　陸才德

原發(fā)性肝癌是國(guó)人最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床治療肝癌最有效的方法是手術(shù)切除，但我國(guó)大部分肝癌患者有乙型肝炎肝硬化背景，肝硬化后肝臟可切除體積減少，術(shù)后往往出現(xiàn)肝臟剩余體積不足，導(dǎo)致肝衰竭。2012年德國(guó)學(xué)者首次報(bào)道了一種新的手術(shù)方式-聯(lián)合門靜脈結(jié)扎與原位肝臟劈離的二步肝切除術(shù)（associating liver partition with portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS）[2]。ALPPS可在短期內(nèi)大大增加術(shù)后肝臟剩余體積，提高手術(shù)切除率，但該術(shù)式主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性肝癌[3]，應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的報(bào)道少見。目前已有正常大鼠ALPPS模型建立的報(bào)道[4-5]。本研究在肝硬化大鼠上成功建立ALPPS模型，現(xiàn)報(bào)道如下，以供同行參考。

1　材料和方法

1.1材料113只健康雄性SD大鼠購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，周齡6～8周，體重（200±20）g。四氯化碳（CCl4）、1%戊巴比妥鈉購(gòu)于寧波航景生物有限公司，青霉素購(gòu)于山東圣旺藥業(yè)有限公司，蘇木素-伊紅購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。手術(shù)顯微鏡購(gòu)于美國(guó)Olympus公司，顯微外科手術(shù)器械為北京北方三友醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品，托盤天平購(gòu)于寧波市義久電子科技有限公司，單微級(jí)電凝購(gòu)于廣州市邦善醫(yī)療器械有限公司，2-0絲線、5-0絲線、8-0絲線為美國(guó)強(qiáng)生公司產(chǎn)品，自制鼠臺(tái)。

1.2方法

1.2.1大鼠肝硬化模型建立采用腹腔注射CCl4的方法建立大鼠肝硬化模型[6]，60%CCl4的橄欖油溶液3ml/g腹腔皮下注射，3次/周。50只大鼠按腹腔注射CCl4的時(shí)間分為正常組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為4周組、8周組、12周組、16周組，每組10只。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別于第4、8、12、16周末處死大鼠，正常組于16周末處死大鼠。

1.2.2肝硬化大鼠ALPPS模型建立[圖1、圖2（見插頁(yè)）]選取成模率最高的實(shí)驗(yàn)組，按照該組方法再建肝硬化大鼠模型50只。該50只肝硬化大鼠行ALPPS。所有操作均在清潔的環(huán)境下實(shí)施。所有大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。手術(shù)方法：1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部剃毛后，固定于鼠板，消毒鋪巾，放置于顯微鏡下，作正中切口，逐層開腹；開腹后首先游離大鼠鐮狀韌帶，沿肝葉游離肝周韌帶，充分松解肝臟，用濕潤(rùn)棉簽將肝葉翻出腹腔，暴露肝門結(jié)構(gòu)，注意切勿暴力翻轉(zhuǎn)，避免肝臟劃傷；自門靜脈下端向上端分離門靜脈，避免損傷膽管；沿各肝葉外解剖門靜脈分支，并使與之伴行的肝動(dòng)脈與肝膽管之間有較充分的空隙。大鼠肝臟按順時(shí)鐘方向分為尾葉、右葉、中葉、左內(nèi)葉、左外葉、乳頭葉，各葉具有相對(duì)獨(dú)立的Glisson系統(tǒng)和脈管回流系統(tǒng)，用5-0絲線分別結(jié)扎大鼠尾葉、右葉、左外葉、左內(nèi)葉處門靜脈分支，保留中葉及乳頭葉血供。當(dāng)出現(xiàn)右葉與左內(nèi)葉缺血線后作標(biāo)記，采用8-0絲線結(jié)扎左右肝實(shí)質(zhì)后用顯微剪沿缺血線標(biāo)記進(jìn)行肝實(shí)質(zhì)劈離。肝斷面出血點(diǎn)用8-0絲線結(jié)扎或用微單級(jí)電凝止血。最后，用無(wú)菌塑料薄膜包裹肝斷面，防止術(shù)后斷面粘連，術(shù)后用5%葡萄糖氯化鈉溶液5ml腹腔內(nèi)滴注，予2-0絲線關(guān)腹；術(shù)畢，青霉素20萬(wàn)U/kg大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射，38℃電熱毯復(fù)溫至大鼠蘇醒。術(shù)后7d處死大鼠，觀察肝臟結(jié)構(gòu)。

圖1　SD大鼠各門靜脈分支、肝葉比重及ALPPS示意圖

1.3觀察指標(biāo)各組肝硬化大鼠處死后，肝臟組織固定保存于甲醛溶液中，組織切片后行HE染色，在Olympus顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化，以出現(xiàn)假小葉視為建模成功，比較各組大鼠成模率。肝硬化大鼠ALPPS模型以大鼠術(shù)后存活7d及以上視為建模成功，觀察肝硬化大鼠ALPPS建模成功率。

2　結(jié)果

2.1肝硬化大鼠建模結(jié)果

2.1.1一般情況4周組、8周組、正常組大鼠至處死時(shí)間前全部存活（死亡率0.0%），12周組大鼠至處死時(shí)間前死亡2只（死亡率20.0%，），16周組大鼠至處死時(shí)間前死亡7只（死亡率70.0%）。解剖死亡大鼠，腹腔未見明顯損傷，考慮長(zhǎng)時(shí)間腹腔注射CCl4，個(gè)體劑量不耐受，中樞抑制、呼吸衰竭致死亡。12周組成模率最高，為80.0%，各組大鼠成模率比較見表1。

表1　各組大鼠成模率比較

2.1.2大鼠肝臟改變見圖3（插頁(yè)）。

由圖3可見，正常組大鼠肝臟被膜光滑，呈暗紅色，質(zhì)地中等，邊緣銳利。實(shí)驗(yàn)組大鼠隨著腹腔注射CCl4時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟被膜見部分纖維化，色澤較正常肝臟暗淡，質(zhì)地偏硬，邊緣圓鈍，肝臟被膜與鄰近器官有輕度粘連；肝臟病理改變?yōu)楦渭?xì)胞脂肪變性和炎癥同時(shí)存在，肝組織出現(xiàn)不同程度的水樣變性及氣球樣變性，變性程度輕者肝細(xì)胞腫大，胞質(zhì)疏松、淡染，有些肝細(xì)胞內(nèi)可見小空泡形成，變性程度較重者細(xì)胞體積明顯增大變圓；隨著腹腔CCl4注射時(shí)間的延長(zhǎng)，8周組炎癥及脂肪變性最明顯，12周組可見肝纖維化明顯增加。

2.2肝硬化大鼠ALPPS建模結(jié)果本研究選擇12周組肝硬化大鼠為行ALPPS的大鼠。50只肝硬化大鼠，術(shù)后存活7d及以上40只，建模成功率為80.0%，手術(shù)時(shí)間（26.75±12.15）min；死亡原因主要為術(shù)前麻醉過深，術(shù)中失血、膈肌穿孔、下腔靜脈損傷、肝靜脈分支損傷，術(shù)后肝功能衰竭、膽瘺、腹腔感染。存活大鼠7d后處死可見肝右中葉明顯增大。

3　討論

CCl4是建立肝硬化大鼠模型的常見誘導(dǎo)劑，其主要的誘導(dǎo)機(jī)制是是氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過細(xì)胞色素p450介導(dǎo)活化引起的實(shí)驗(yàn)性肝損傷的自由基[7]，影響肝細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，纖維結(jié)締組織明顯增生，最終形成肝硬化。腹腔注射具有操作簡(jiǎn)便、動(dòng)物吸收快、肝藥物濃度高、成模時(shí)間短、毒副作用降低等優(yōu)點(diǎn)，死亡率為20%～35%[8]。崔承虎等[9]報(bào)道腹腔注射給藥肝硬化建模效果優(yōu)于皮下注射和灌胃方法，大鼠死亡率腹腔注射、皮下注射、灌胃依次升高。本研究需二次建模，需選擇肝硬化成模率高且建模時(shí)間短的方法，保證行ALPPS手術(shù)時(shí)，大鼠盡可能處于壯年期，減少鼠齡對(duì)ALPPS效果的影響。

SD實(shí)驗(yàn)大鼠是一種應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在解剖和組織結(jié)構(gòu)、生理現(xiàn)象、生化代謝、疾病的發(fā)生機(jī)理特點(diǎn)等方面與人類很相似。大鼠肝臟按順時(shí)鐘方向分為尾葉、右葉、中葉、左內(nèi)葉、左外葉、乳頭葉，各葉具有相對(duì)獨(dú)立的Glisson系統(tǒng)和脈管回流系統(tǒng)，各肝葉形態(tài)、比例較為恒定，易行門靜脈分支的分離和結(jié)扎，而對(duì)其他肝葉無(wú)影響[10]。另外，大鼠肝中葉與左內(nèi)葉解剖上雖然相連，但血供獨(dú)立，為肝實(shí)質(zhì)離斷模型建立創(chuàng)造條件。有學(xué)者采用保留中葉的血供，劈離肝中葉與左內(nèi)側(cè)葉術(shù)式的ALPPS模型，其保留的殘肝約為28%[10]。筆者曾用16周組大鼠與12周組大鼠行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示16周組與12周肝硬化大鼠行ALPPS后，7d內(nèi)大鼠均死亡，考慮肝硬化后，術(shù)后肝剩余體積不足，出現(xiàn)肝衰竭死亡。為此，筆者參考SD大鼠肝葉的解剖[11]，增加了不結(jié)扎肝葉的數(shù)量，保留中葉及乳頭葉的血供，其保留的殘肝約為35%。但筆者發(fā)現(xiàn)16周組大鼠依然無(wú)法耐受手術(shù)，而12周組肝硬化大鼠尚能耐受手術(shù)，其原因可能是16周組大鼠肝硬化更為嚴(yán)重。另外，分析肝硬化大鼠成模率，16周組大鼠肝硬化成模率遠(yuǎn)低于12周組，故本實(shí)驗(yàn)采用12周組肝硬化大鼠作為ALPPS建模大鼠。

筆者總結(jié)ALPPS操作要點(diǎn)如下。（1）手術(shù)入路：開腹時(shí)應(yīng)選擇正中切口，防止腹壁靜脈損傷，減少出血，且切口不易過大，以4～5cm為宜，避免腸管外露影響操作，同時(shí)避免術(shù)后感染風(fēng)險(xiǎn)的增加。（2）手術(shù)暴露：因大鼠肝臟位于橫膈下的上腹部，位置較高，常規(guī)難以暴露，可在大鼠背部墊高，使肝臟位置下移，易于暴露；肝鐮狀韌帶是肝中葉和左內(nèi)葉的分隔標(biāo)志，切斷此韌帶時(shí)，應(yīng)在明視下操作，防止損傷膈肌，造成大鼠氣胸死亡。（3）術(shù)中結(jié)扎：肝十二指腸韌帶起于第一肝門，止于十二指腸，前窄后闊，可在顯微鏡下，先從十二指腸段處分離3者，以絲線分別懸吊；肝背下腔靜脈被肝中葉、左內(nèi)葉及尾狀葉少許肝組織包繞，結(jié)扎右葉及尾葉時(shí)，應(yīng)盡量在肝外解剖Glisson系統(tǒng)，且探針方向盡量沿矢狀位解剖，避免探針捅傷肝背下腔靜脈，引起術(shù)中難以控制的大出血。左外葉、左內(nèi)葉血管共干，目前傾向于將左內(nèi)葉與肝中葉視為同一解剖單位[11-12]，在肝外辨別其血管共干，避免單支結(jié)扎。（4）肝葉劈離：上述血管結(jié)扎后，正常大鼠可于中葉及左內(nèi)葉見一明顯缺血線，但肝硬化大鼠肝臟色澤較深，有時(shí)并不明顯。行肝中葉及左內(nèi)葉劈離時(shí)，可沿鐮狀韌帶右側(cè)約1mm進(jìn)行。因肝中葉靜脈直接匯入腔靜脈，與肝鐮狀韌帶平面幾乎垂直，要避免損傷肝中葉靜脈，以免造成術(shù)中大出血及血管內(nèi)氣栓。

綜上所述，在CCl4腹腔注射法建立肝硬化大鼠模型上行ALPPS是安全可行的，可增大術(shù)后肝臟剩余體積。

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