馬凌燕，馬惠姿，馮濤

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)變性病科，北京市100050

肌張力障礙(dystonia)是一種以持續(xù)或間歇性肌肉收縮所致的動(dòng)作和/或姿勢異常為特征的運(yùn)動(dòng)障礙，常反復(fù)發(fā)作，有典型發(fā)作模式和肢體扭曲，并可伴有震顫[1-2]。孤立性肌張力障礙(isolated dystonia)臨床上僅表現(xiàn)為肌張力障礙，包括扭轉(zhuǎn)痙攣、眼瞼痙攣、口下頜肌張力障礙、痙攣性斜頸、痙攣性構(gòu)音障礙、書寫痙攣等。孤立性肌張力障礙是一類病理生理復(fù)雜、機(jī)制未明的運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，研究表明多數(shù)患者存在基因異常的生理基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)，20余種基因與肌張力障礙相關(guān)[3-6]，但大多數(shù)散發(fā)孤立性肌張力障礙患者致病基因檢出率低，可能與多種因素有關(guān)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)作為人類可遺傳變異中最常見的一種，常用來評估人群遺傳易感性。已發(fā)現(xiàn)十余個(gè)SNP與孤立性肌張力障礙相關(guān)，其中 rs1801968(D216H)[7]、rs1182[8]、rs3842225[9]與局灶型或節(jié)段型肌張力障礙相關(guān)，rs6265(BNDF Val66met)與伴有上肢震顫的痙攣性斜頸相關(guān)[9-10]。

Zech等[11]采用全外顯子測序?qū)Φ聡粋€(gè)常染色體隱性遺傳早發(fā)型肌張力障礙家系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)COL6A3可能是其致病基因。該基因位于2q37，包含43個(gè)外顯子，編碼Ⅵ型膠原蛋白α3亞單位。另有研究對955例肌張力障礙患者進(jìn)行COL6A3基因41和42外顯子篩查，未檢測到明確致病突變，提示突變概率極低[12]。

散發(fā)肌張力障礙占肌張力障礙的多數(shù)，從遺傳易感性SNP入手研究COL6A3基因與肌張力障礙相關(guān)性成為可能。本研究從遺傳易感性方面探討COL6A3基因多態(tài)性與中國人群散發(fā)孤立性肌張力障礙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年9月至2017年8月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科運(yùn)動(dòng)障礙病門診的散發(fā)孤立性肌張力障礙患者127例，否認(rèn)家族類似病史。根據(jù)受累部位，局灶型肌張力障礙87例(痙攣性斜頸45例，顱段肌張力障礙39例，書寫痙攣2例，痙攣性構(gòu)音障礙1例)，節(jié)段型肌張力障礙31例，全身型肌張力障礙9例。全部患者均符合肌張力障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，并通過病史、體格檢查和輔助檢查排除繼發(fā)性肌張力障礙，包括圍產(chǎn)期損傷、中毒外傷史、服用抗精神病藥物、查體存在病理征、影像學(xué)檢查提示基底節(jié)區(qū)存在可以解釋相關(guān)癥狀的異常信號、血液檢查(銅藍(lán)蛋白、血清銅、24 h尿銅、有機(jī)酸等)異常及其他可導(dǎo)致肌張力障礙的疾病。所有患者均排除DYT1/TOR1A及DYT6/THAP1異常。

同期130例既往健康，無神經(jīng)系統(tǒng)疾病，性別、年齡與患者匹配的健康體檢者作為對照組。兩組一般資料見表1。

所有受試者均簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

表1 受試者一般資料比較

1.2 SNP篩選

參考Hapmap計(jì)劃篩選標(biāo)準(zhǔn)，在千人基因組數(shù)據(jù)庫(http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)中進(jìn)行COL6A3基因41外顯子SNP篩選，以總體人群、歐洲人群、非洲人群、美洲人群、亞洲南部人群及亞洲東部人群最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)＞0.05為標(biāo)準(zhǔn)選取目標(biāo)SNP。

1.3 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)

受試者采集靜脈血2～3 ml，應(yīng)用QIAGEN全基因組DNA提取試劑盒從全血中提取基因組DNA。PCR-RFLP檢測COL6A3基因多態(tài)性。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。χ2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)計(jì)算Hardy-Weinberg平衡。計(jì)量資料采用方差分析，基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。對于不同基因型(3組)間發(fā)病年齡比較，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)SNP

共得到符合條件SNP位點(diǎn)2個(gè)，分別為rs1131296和rs2270669，它們在亞洲東部人群的MAF分別為0.4802、0.7312。

rs1131296引物序列：上游5'-TCC CAT TTC CAT TCT GTG TTT-3'，下游5'-TTC ACA TTT CAT GTA TGC TGATAGA-3'。

rs2270669引物序列：上游5'-TCC CAT TTC CAT TCT GTG TTT-3'，下游5'-TTC ACA TTT CAT GTA TGC TGATAGA-3'。

2.2 基因型及等位基因頻率分布

兩組Val66Met位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。見表2。rs1131296在病例組和對照組中GG、GA、AA基因型分布，以及等位基因頻率無顯著性差異(P＞0.05)。rs2270669在病例組和對照組中CC、CG、GG基因型分布，以及等位基因頻率無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組基因型及等位基因頻數(shù)比較(n)

2.3 不同基因型間起病年齡

病例組中，rs1131296 GG型起病年齡(42.86±14.79)歲，GA型(38.36±12.34)歲，AA型(40.58±15.78)歲(F=0.100,P=0.905)。rs2270669 CC型起病年齡(39.58±15.12)歲，CG型(40.36±13.59)歲，GG型(42.58±10.73)歲(F=0.074,P=0.929)。2個(gè)SNP中3個(gè)基因型患者起病年齡無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

本研究顯示，肌張力障礙患者基因型和等位基因分布與對照組無顯著性差異，各基因型間起病年齡也無顯著性差異，提示COL6A3基因41外顯子多態(tài)性與我國散發(fā)孤立性肌張力障礙無關(guān)。

Zech等[11,13]發(fā)現(xiàn)COL6A3基因復(fù)合雜合突變可能與常染色體隱性遺傳肌張力障礙有關(guān)。在3個(gè)存在COL6A3基因突變的德國家系共5例患者中，所有患者均為早發(fā)型肌張力障礙，起病年齡＜25歲；其中3例以斜頸起病，2例以手部肌張力障礙起病，癥狀可在數(shù)年內(nèi)逐漸進(jìn)展至身體其他部分，表現(xiàn)為局灶型或節(jié)段型肌張力障礙。這3個(gè)家系中共存在5個(gè)突變，分 別 為 c.9128G＞A(p.Arg3043His)+c.9245C＞G(p.Pro3082Arg)、c.8966-1G＞C(p.Val2989_Lys3077delins-Glu)+c.7502G＞A(p.Arg2501His)、 c.8966-1G＞C(p.Val2989_Lys3077delinsGlu) + c.7660G＞A (p.Ala2554Thr)，所有患者均在41號外顯子存在基因突變。此后其對367名孤立性肌張力障礙患者和376名正常對照進(jìn)行COL6A3基因篩查，發(fā)現(xiàn)2例COL6A3基因突變所致肌張力障礙患者和另外43個(gè)突變位點(diǎn)(雜合子)，患者雜合子檢出率為9.5%(35/367)，對照組檢出率為6.1%(23/376)[11,14]。

COL6A3基因位于2q37，包含43個(gè)外顯子，編碼Ⅵ型膠原蛋白α3亞單位[15-16]。該蛋白為異源三聚體，是一種細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)蛋白，能夠產(chǎn)生微纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在全身各處均有表達(dá)，成年大鼠腦中以腦干和中腦表達(dá)量最高[11]。ECM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與神經(jīng)發(fā)育和退行病變[17-18]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膠原蛋白不僅發(fā)揮結(jié)構(gòu)連接功能，而且廣泛參與細(xì)胞生理過程，包括神經(jīng)環(huán)路形成和維持[19-20]。

Ⅵ型膠原蛋白由3個(gè)α鏈組成，α1(Ⅵ)、α2(Ⅵ)、和α3(Ⅵ)，分別由 COL6A1、COL6A2和COL6A3基因編碼，每個(gè)都有N-末端和C-末端非膠原結(jié)構(gòu)域，由三螺旋結(jié)構(gòu)連接。以前的研究發(fā)現(xiàn)，COL6A3基因突變與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，特別是骨骼肌疾病，如Ullrich先天肌萎縮和Bethlem肌病[7-8,15,21]。但COL6A3基因突變的肌張力障礙患者M(jìn)RI未見肌肉萎縮征象。另外發(fā)現(xiàn)，所有COL6A3型肌張力障礙患者至少存在1個(gè)影響41號外顯子的突變位點(diǎn)(位于41號外顯子內(nèi)或其內(nèi)含子中)，推測肌張力障礙發(fā)病可能與該外顯子編碼蛋白結(jié)構(gòu)域受損有關(guān)。

突觸可塑性受損是肌張力障礙發(fā)病機(jī)制之一[22-25]。COL6A3基因41號外顯子編碼Ⅵ型膠原蛋白α3的部分C4結(jié)構(gòu)域(FN-Ⅲ模體)，可能參與突觸結(jié)構(gòu)可塑性而發(fā)病[26]。推測與肌張力障礙發(fā)病相關(guān)的COL6A3基因突變發(fā)生在α3(Ⅵ)鏈的C-末端，至少有1個(gè)突變位點(diǎn)位于41號外顯子，而肌病相關(guān)的致病突變多位于N-末端和三螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)[27-30]，基因突變部位不同而導(dǎo)致不同疾病，并可將肌張力障礙與其他肌肉疾病加以區(qū)分。COL6A3基因突變所致肌張力障礙在同一家系中表現(xiàn)非常相似，但不同家系差異較大。

目前僅有一項(xiàng)肌張力障礙COL6A3基因篩查研究[12]，納入955例孤立性或混合性肌張力障礙患者(898例高加索人種，57例亞洲人，不含中國)，首先對COL6A3基因的41和42號外顯子進(jìn)行篩查，對篩查出的9例突變攜帶者檢測其余41個(gè)外顯子，未發(fā)現(xiàn)致病突變，提示COL6A3基因非肌張力障礙常見致病原因。

SNP作為人類可遺傳變異中最常見的一種，常用來評估人群中遺傳易感性。已發(fā)現(xiàn)十余個(gè)SNP與孤立性肌張力障礙相關(guān)，但不同基因、不同人群結(jié)果差異較大。目前尚無關(guān)于COL6A3基因多態(tài)性與肌張力障礙相關(guān)性研究。鑒于既往研究提示COL6A3基因41號外顯子可能在肌張力障礙的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，我們對41號外顯子進(jìn)行SNP篩查，發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)：rs1131296和rs2270669。研究顯示，這兩個(gè)位點(diǎn)SNP均與中國散發(fā)孤立性肌張力障礙無關(guān)。

本研究存在一定局限性。本研究是基于醫(yī)院的病例-對照研究，選擇偏倚難以避免；多態(tài)性位點(diǎn)位于COL6A3基因41號外顯子上，可能不能完全代表整個(gè)基因易感性情況。尚需大規(guī)模研究支持。

本研究顯示，COL6A3基因41外顯子多態(tài)性并非中國孤立性肌張力障礙人群的遺傳易感因素。今后可擴(kuò)展至COL6A3基因多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，在不同人群、大樣本病例研究中證實(shí)。

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