程 茹，吳玉娥，陳吉香，謝體波，李 平，何方洋，張 凱，吳紫潔，鐘新敏，袁光宇

(貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州貴陽 550009)

阿維菌素類藥物是由放線菌產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其對(duì)線蟲、體外節(jié)肢動(dòng)物有較強(qiáng)的驅(qū)殺作用，是目前應(yīng)用最廣泛的抗寄生蟲類藥物[1-5]。但是此類藥物的脂溶性較高，且具有神經(jīng)毒性和發(fā)育毒素，在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的停留，會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生巨大傷害，因此，其被WHO列為高毒性化合物[6]。中國(guó)、美國(guó)、歐盟、食品法典委員會(huì)等均制定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量，便于更好地加強(qiáng)此類藥物的殘留監(jiān)測(cè)，以保障我國(guó)食品安全。

阿維菌素類藥物是帶雙糖支鏈的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其分子量大，極難被氣化，因而無法應(yīng)用氣相色譜檢測(cè)其物質(zhì)含量[7-9]。目前主要的試驗(yàn)手段包括液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)[10]、液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)[11]、免疫親和色譜技術(shù)(IAC)[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[14]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[15]及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[16]等。筆者采用建立的ELISA法檢測(cè)雞肉和蝦肉樣本中的阿維菌素類藥物含量，此法分析時(shí)間短、可操作性強(qiáng)，并與高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，以驗(yàn)證貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司研制的阿維菌素類藥物酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)水平是否達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，從而為動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物的快速檢測(cè)提供符合要求的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本與試劑。雞肉、蝦肉鮮肉(購(gòu)自貴陽小河沃爾瑪超市)，其中雞肉取雞胸脯肉、蝦肉取蝦身中間部位；阿維菌素類藥物試劑盒(貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司自主研發(fā))，其中含有96孔酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品×6瓶(0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L，1 mL/瓶)、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(1 μg/mL，1 mL/瓶)、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、底物A液、底物B液、終止液、20×濃縮洗滌液、2×濃縮復(fù)溶液；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，美國(guó)Sigma公司；乙腈、正己烷(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2儀器與設(shè)備。高速電動(dòng)勻漿機(jī)(FTH-Ⅱ型，浙江中天機(jī)械廠)；恒溫振蕩器(CWZ-96B，杭州雅極儀器制造有限公司)；高速離心機(jī)(GS39-3B，上海先鋒北利設(shè)備有限公司)；渦旋儀(ST-902型，江蘇南京市奧華制造儀器廠)；分析天平(BLC-210.5型，德國(guó)Sartorius公司)；超聲波振蕩清洗器(GW SONIC-M4，深圳固特超聲責(zé)任有限公司)；微量移液器(單道20～200、100～1 000 μL，多道250 μL，美國(guó)Thermo公司)；高效液相色譜(配熒光檢測(cè)器，LC-3000，美國(guó)安捷倫公司)。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫法試驗(yàn)檢測(cè)原理。采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附劑法(ELISA)測(cè)定樣品中的阿維菌素類藥物，通過在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，則樣本中殘留的阿維菌素類藥物和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗阿維菌素類藥物的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色，樣本測(cè)定的吸光度與其所含殘留物阿維菌素類藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)樣本測(cè)定的吸光度，進(jìn)一步通過標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出樣本中阿維菌素類藥物的殘留量。

1.2.2樣品前處理。

1.2.2.1溶液的配制。

(1)復(fù)溶工作液。用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1∶1體積比進(jìn)行稀釋(1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)，用于茶葉和蔬菜樣本的稀釋。復(fù)溶工作液在4 ℃環(huán)境可保存1個(gè)月。

(2)洗滌工作液。用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進(jìn)行稀釋(1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)，用于酶標(biāo)板的洗滌。洗滌工作液在4 ℃環(huán)境可保存1個(gè)月。

1.2.2.2樣本預(yù)處理。取2支50 mL經(jīng)清洗、干燥、滅菌的聚苯乙烯離心管，各精確稱取已經(jīng)破碎均質(zhì)處理的雞肉、蝦肉組織樣本(3.00±0.05)g，依次加入9 mL乙腈、3 mL正己烷，在恒溫振蕩器中振蕩10 min，再以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速，15 ℃下，離心5 min。精確移取1 mL下層液于10 mL潔凈干燥的玻璃試管中，將其置于50～60 ℃水浴氮?dú)饬髦写蹈桑偌尤? mL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)60 s，超聲波溶解10 min，再繼續(xù)用渦旋儀渦動(dòng)60 s。移取100 μL溶解后的樣本液，加入100 μL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)30 s，混勻，取20 μL用于分析。

1.2.3樣本中阿維菌素類藥物的測(cè)定。試驗(yàn)前，需保證所有試驗(yàn)所用試劑回溫至20～25 ℃，且不起泡。從試劑盒中取出微孔板，將樣本和阿維菌素藥物的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序進(jìn)行編號(hào)，各做3個(gè)平行，標(biāo)記各自對(duì)應(yīng)位置。一次加入阿維菌素藥物標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各20 μL到對(duì)應(yīng)的微孔中，再繼續(xù)加入抗體工作液80 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后在37 ℃避光靜置30 min。移走蓋板膜，吸水紙吸干各孔中的液體，繼而在各孔中加入250 μL洗滌工作液，每間隔10 s清洗1次，重復(fù)操作5次左右，直至清洗干凈，最后用吸水紙拍干。

再以每孔100 μL的量加入酶標(biāo)二抗，輕輕振蕩均勻，蓋板膜蓋板后在37 ℃避光靜置30 min，取出重復(fù)洗板工作。依次在各孔中加入底物液A液和B液各50 μL，混勻后繼續(xù)用蓋板膜蓋板，在37 ℃避光環(huán)境進(jìn)行顯色反應(yīng)15 min，后在各孔中加入終止液50 μL后混勻，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)，5 min內(nèi)完成測(cè)定過程，讀取每孔OD測(cè)定值。

1.2.4樣品中阿維菌素類藥物濃度的計(jì)算。

1.2.4.1百分吸光率。即為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的平均吸光度(B)除以空白溶液的平均吸光度(B0)，再乘以100%，表達(dá)公式如下：

百分吸光率=B/B0×100%

1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與蝦肉樣本阿維菌素類藥物濃度的計(jì)算。分別對(duì)0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L 6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率測(cè)定值為縱坐標(biāo)，阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制阿維菌素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)線性方程計(jì)算IC50。

將樣品的百分吸光率代入制作好的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)濃度，乘以其對(duì)應(yīng)被稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出樣品中阿維菌素類藥物的實(shí)際濃度。

1.2.5阿維菌素類藥物酶聯(lián)免疫法測(cè)定試劑盒指標(biāo)檢測(cè)方法。分別對(duì)試劑盒的靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行試驗(yàn)，并與儀器分析進(jìn)行比較。

1.2.5.1靈敏度。評(píng)價(jià)免疫法試驗(yàn)反應(yīng)靈敏度常用IC50值和最低檢測(cè)限表示，IC50值即為零標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的50%處對(duì)應(yīng)的藥物濃度，兩者數(shù)值的大小與試劑盒的靈敏程度成反比。樣品采集地區(qū)、種類、預(yù)處理方法等因素與最低限檢測(cè)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，而IC50則不受樣本本身的影響，值相對(duì)不變。兩者結(jié)合，可用于試驗(yàn)所用試劑盒靈敏度指標(biāo)的評(píng)價(jià)。

分別檢測(cè)20組空白雞肉、蝦肉樣品，計(jì)算其所含阿維菌素類藥物的含量，檢測(cè)限為L(zhǎng)OD=S+3SD(S為阿維菌素類藥物的濃度平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差)，根據(jù)下面公式計(jì)算試劑盒檢測(cè)實(shí)際樣品的最低檢測(cè)限。

式中，X為試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定空白樣品的平均值；n為試驗(yàn)測(cè)定樣品數(shù)量。

1.2.5.2特異性。特異性用交叉反應(yīng)率表示，其是衡量抗體與各抗原決定簇結(jié)合能力強(qiáng)弱的指標(biāo)，試驗(yàn)用一定濃度范圍的阿維菌素類藥物類似物取代阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算各藥物交叉反應(yīng)率，交叉反應(yīng)率越低，抗體特異性越好。交叉反應(yīng)率=引起50%抑制的阿維菌素濃度/引起50%抑制的阿維菌素類似物濃度×100%。

1.2.5.3精密度、準(zhǔn)確度。衡量測(cè)定方法對(duì)多研究樣品重復(fù)測(cè)定數(shù)據(jù)的一致程度的指標(biāo)用精密度表示，其是鑒定試劑盒品質(zhì)最為基本的參數(shù)；準(zhǔn)確度是試驗(yàn)測(cè)定值與真實(shí)值間符合性程度的指標(biāo)，這一指標(biāo)大小是通過樣品回收率計(jì)算所得。

在檢測(cè)結(jié)果為陰性的雞肉、蝦肉樣本各添加5、10和20 μg/kg的阿維菌素類藥物，各設(shè)6個(gè)平行，根據(jù)試劑盒設(shè)計(jì)方法進(jìn)行測(cè)定操作，計(jì)算樣品的回收率。

1.2.5.4試劑盒與儀器檢測(cè)結(jié)果比較。分別對(duì)試劑盒和儀器檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度的對(duì)比。試劑盒檢測(cè)方法根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，儀器檢測(cè)分析則參考《農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-5-2006 動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》(動(dòng)物源性食品中阿維菌素類藥物的檢測(cè)限為2 μg/kg)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線以阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。以阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)(log)為橫坐標(biāo)，抑制率ln[B/(B0-B)]為縱坐標(biāo)建立雙對(duì)數(shù)直線擬合曲線如圖2所示，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=-2.124 8x+0.402 4(R2=0.998 6)，說明試劑盒線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Fig.2 Standard curve equation

2.2試劑盒靈敏度由表1可知，空白雞肉和蝦肉樣品的最低檢測(cè)限分別為0.76、0.89 μg/kg；試驗(yàn)測(cè)定得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50為1.8～3.5 μg/L，平均值為2.8 μg/L。綜合以上2個(gè)數(shù)據(jù)可以得出，該試劑盒靈敏度高。

表1 空白樣本測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì) Table 1 Measurement results statistics of blank sample μg/kg

2.3試劑盒特異性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果得各藥物的交叉反應(yīng)率依次為阿維菌素100%、伊維菌素45%、埃比菌素90%、多拉菌素<10%，可見各藥物的交叉反應(yīng)率均不大于100%，表明抗體的特異性均較高。

2.4試劑盒準(zhǔn)確度與精密度從表2可知，阿維菌素在雞肉、蝦肉樣品中的加樣品回收率為92.7%～98.6%，其批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%，表明該款試劑盒符合且高于國(guó)家對(duì)試劑盒的備案標(biāo)準(zhǔn)。

2.5與儀器方法的比較

2.5.1靈敏度。準(zhǔn)備20份隨機(jī)抽取的市場(chǎng)在售的雞肉、蝦肉樣本，2種分析方法測(cè)定結(jié)果見表3，以2 μg/kg為陽性判定線，當(dāng)樣品實(shí)際檢測(cè)結(jié)果低于這一判定線，則以“—”表示，高于或等于時(shí)則以實(shí)際測(cè)定值表示。從表3的檢測(cè)結(jié)果中可得，2種手段所得檢測(cè)結(jié)果相近，從11號(hào)、15號(hào)樣品的檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證，試劑盒的檢測(cè)限較儀器更低，更易檢測(cè)出阿維菌素類藥物低殘留的樣品。由此可知，該試劑盒法的檢測(cè)符合國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)且優(yōu)于儀器檢測(cè)。

表2 阿維菌素準(zhǔn)確度和精密度

2.5.2精密度和準(zhǔn)確度。分別按照高效液相色譜和自制試劑盒檢測(cè)提供的方法，以5 μg/kg濃度對(duì)空白雞肉、蝦肉進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，比較儀器檢測(cè)方法和自制試劑盒檢測(cè)方法的平均回收率和變異系數(shù)。自制試劑盒檢測(cè)方法中，將添加樣品在3塊不同酶標(biāo)板上測(cè)定，做4個(gè)平行，計(jì)算變異系數(shù)。

由表4可知，雞肉樣品中HPLC-FLD的平均回收率為95.2%，變異系數(shù)為8.7%；ELISA的平均回收率為95.7%～98.5%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10.0%。蝦肉樣品中HPLC-FLD的平均回收率為95.6%，變異系數(shù)為6.1%；ELISA的平均回收率在92.8%～98.3%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10.0%。結(jié)果表明自研試劑盒適于實(shí)際樣品的阿維菌素類藥物含量的快速精準(zhǔn)檢測(cè)。

3 結(jié)論

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)雞肉和蝦肉中阿維菌素類藥物的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，并與高效液相色譜法進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，自主研發(fā)的阿維菌素類藥物ELISA檢測(cè)試劑盒靈敏度高，特異性好，準(zhǔn)確度與精密度均滿足我國(guó)獸藥殘留分析的要求。該方法與儀器檢測(cè)結(jié)果一致，但其檢測(cè)成本低、耗時(shí)短、操作時(shí)間短，能大大減少操作誤差和工作強(qiáng)度，可滿足動(dòng)物源性食品中阿維菌素類藥物的現(xiàn)場(chǎng)批量快速檢測(cè)需求。

表3自研試劑盒與儀器方法靈敏度比較

Table 3 Compare of sensitivity of the experimental kit and the instrument method μg/kg

表4 精密度和準(zhǔn)確度吻合情況檢測(cè)結(jié)果Table 4 The consistent detection results of precision and accuracy %

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