李方舟，溫 飛，杜燁青，張利坤，白秦生，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省秦勝牧業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 扶風(fēng) 7222064)

人工授精技術(shù)(Artificial insemination, AI)可提高和保障羊的繁殖效率，促進良種羊的繁育，是一種已被大范圍推廣和應(yīng)用的現(xiàn)代繁殖技術(shù)，為實現(xiàn)羊產(chǎn)業(yè)工業(yè)化、集約化奠定基礎(chǔ)[1]。人工授精技術(shù)的關(guān)鍵則是精液的稀釋保存。在實際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖企業(yè)多采用羊精液低溫保存技術(shù)[2]。鄭丕留等[3]研究發(fā)現(xiàn)，羊精液在3～5 ℃時精子活力最佳。孟娜娜等[4]在綿羊精液低溫保存試驗中，用大豆卵磷脂代替卵黃，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加濃度為0.375%時保存效果最好。陳宗明等[5]在山羊精液低溫保存試驗中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加維生素C能有效提高精液品質(zhì)。在低溫條件下，由于精子代謝活動水平降低，營養(yǎng)物質(zhì)消耗減少，會有效延長精子的生命周期[6]。但在精液的低溫保存過程中，隨著保存時間的延長，精液活性氧(Reactive oxygen species, ROS)含量偏高，氧化平衡遭到破壞，精子會發(fā)生脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、膜透性失效、蛋白質(zhì)磷酸化等等一系列損害其生命的現(xiàn)象，進而影響精液低溫保存效果[7-10]。因此，向低溫稀釋液中添加抗氧化物是必要的舉措。褪黑素(Melatonin, MLT)是一種由松果腺合成和分泌的重要胺類激素，具有抗氧化能力，可保護細胞的細胞膜脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等成分[11]。近年來已有許多研究中將褪黑素作為抗氧化劑運用到動物精液體外保存中，如豬精液低溫保存[12]。但褪黑素在羊精液低溫保存中的應(yīng)用尚不多見，且其對羊精液的低溫保存添加量以及影響效果尚不明確。本試驗以不同濃度褪黑素添加到基礎(chǔ)稀釋液中，通過對精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性、線粒體活性等指標的測定，進行精液品質(zhì)分析，以期為羊精液低溫保存稀釋液配方的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要試驗設(shè)備有顯微鏡(南寧松景天倫)、熒光顯微鏡(日本 Nikon)、恒溫加熱板、水浴箱、酶標儀(寶特Bio-Tek)、移液器(Sigma公司)、冰箱等。褪黑素、D-果糖、檸檬酸鈉、PVA、EDTA、碳酸酸鈉、葡萄糖、碘化丙啶(PI)、羅丹明123(Rh123)、二甲基亞砜(DMSO)等(均為sigma公司生產(chǎn))；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自上海佳和生物公司、HOST低滲膨脹試劑盒(GMS14017)購自Genmed 公司。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗其分為五組，每組設(shè)三個重復(fù)。每組低溫保存稀釋液中分別加入褪黑色素0、10、20、40、80 mg/L。用各組低溫保存稀釋液稀釋山羊精液，通過測定、分析各組5 d內(nèi)的精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性、線粒體活性評價不同褪黑色素添加量在山羊精液低溫保存時的效果，并篩選出褪黑色素的最佳添加量。

1.3 精液樣品的采集

試驗所用精液為陜西大荔某牧業(yè)有限公司2～3歲的健康薩?？斯颍眉訇幍婪ú杉汉?，并立即進行活率檢查，選擇精子活率0.8以上精液放置于36～38 ℃保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實驗室用于試驗。

1.4 溶液的配制

羊精液低溫保存基礎(chǔ)稀釋液：葡萄糖 1.15 g, D-果糖 1.45 g, 碳酸氫鈉 0.125 g, 檸檬酸鈉 1.17 g, PVA 0.25 g, EDTA 0.23 g, 青霉素 5 000 IU, 鏈霉素 0.1 g,融于100 mL超純水中。

抗氧化劑添加：在各組稀釋液中分別添加0、10、20、40、80 mg/L的褪黑素， 37 ℃下水浴靜置30 min，待其冷卻后，于4 ℃冰箱保存。

碘化丙啶(PI)貯存液：0.000 2 g PI 溶于10 mL PBS中，0.45 μm 濾膜過濾后，-20 ℃避光貯存。

羅丹明123(Rh123)貯存液：0.000 2 g 羅丹明123溶于1 mL DMSO，0.45 μm濾膜過濾后，避光貯存。

1.5 精液的稀釋

精液采集前1 h，將稀釋劑放置于37 ℃的水浴鍋中。分別用5種含有不同濃度褪黑素的稀釋液(0、10、20、40、80 mg/L)，按照稀釋液與精液 8:1 的比例分次將等溫稀釋液沿容器壁緩慢加入精液中，將精液進行稀釋，并分別檢測稀釋后每組的精子活率。然后再將其裹上16層紗布放入4 ℃冰箱中(梯度降溫)，每12 h應(yīng)翻動一次精液；每24 h檢測其活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率等。

1.6 指標檢測

1.6.1 精子活率 精液搖勻后，取10 μL中層稀釋精液制片，在37 ℃溫度下，做顯微鏡(400×)檢查，用估測法判定精子活率。

1.6.2 質(zhì)膜完整率 用HOST試驗法[13]進行精子質(zhì)膜完整率測定。取20 μL 解凍孵育后的精液樣品，在其中加入等溫HOST 低滲溶液 200 μL 混勻，然后置于37 ℃恒溫水浴鍋中，30 min后，在顯微鏡下觀察精子尾部的彎曲率(每組5個重復(fù)，每個重復(fù)不少于200枚精子)。

1.6.3 頂體完整率 采用姬姆薩染色法檢測[14-15]測定頂體完整率。分別吸取30 μL試驗組精液制片，自然干燥后用5%福爾馬林溶液固定10 min，然后水洗，風(fēng)干，再在姬姆薩液中染色1.5～2 h，洗去浮色，風(fēng)干，在1000×顯微鏡下檢查并計算頂體完整率(每次不少于200枚精子，重復(fù)5次)。

1.6.4 線粒體活性 取五個試管，在每個試管中分別加入PI貯存液1 μL、Rh123貯存液1 μL，避光培養(yǎng)10 min；取等溫基礎(chǔ)稀釋液將各試驗組精液稀釋，調(diào)整精子密度至3×106～6×106。吸取50 μL稀釋后的精液，加入上述避光培養(yǎng)的混合液中，37 ℃黑暗潮濕環(huán)境中培養(yǎng)30 min。然后取每組精液10 μL滴在載玻片上，在熒光顯微鏡(400×)下觀察，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)不少于200個精子，計算完整線粒體的精子的百分率。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗所得數(shù)據(jù)用 Excel 2013對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，用SPSS22.0對結(jié)果進行方差分析，用Duncan法進行均值的多重比較，結(jié)果用“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對低溫稀釋保存后的羊精子活率的影響

由表1可知，精液低溫保存0 d時，各試驗組差異不顯著(P> 0.05)，表明精液剛稀釋完時褪黑素對精液無明顯影響。精液低溫保存1 d時，加入不同濃度的褪黑素均能提高精子活率。而濃度為20 mg/L褪黑素試驗組在各個時間段的精子活率均最高，且差異顯著(P<0.05)；而濃度80 mg/L褪黑素處理組效果最差，甚至低于沒有加褪黑素的對照組。

2.2 褪黑素對低溫保存后的羊精子質(zhì)膜的影響

本研究中，精液剛稀釋完時，五組的精子質(zhì)膜完整率無差異(P>0.05)；從保存的第3天開始，20 mg/L的褪黑素試驗組，精子質(zhì)膜完整率顯著高于其他各試驗組(P<0.05)；在保存期間，10、20、40 mg/L褪黑素均能提高精子質(zhì)膜完整率，而80 mg/L褪黑素小組在保存期間的處理效果均表現(xiàn)最差，顯著低于其他各組(P<0.05)。

2.3 褪黑素對低溫保存后的羊精子頂體的影響

本研究中，精液保存2 d后，濃度為10和20 mg/L褪黑素試驗組的精子頂體完整率顯著高于濃度為40和80 mg/L褪黑素試驗組(P<0.05)。精液保存3 d后，濃度為20 mg/L褪黑素處理組的精子頂體完整率均顯著高于其他各組(P<0.05)；而在精液保存期間，濃度為80 mg/L褪黑素試驗組的精子頂體完整率顯著低于其他各組(P<0.05)，甚至低于無褪黑素添加的對照組。

表1 不同濃度褪黑素對羊精液低溫保存效果的影響Table 1 Effect of different concentrations of meletonin on conservation effect of sheep sperm at low temperture %

注:同行數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letter in the same row indicate significant difference(P<0.05)，same letter indicate insignificant difference(P>0.05).

2.4 褪黑素對低溫保存后的羊精子線粒體活性的影響

本研究中，精子線粒體活性隨著褪黑素濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。精液保存1～4 d時，褪黑素濃度為20 mg/L組線粒體活性均高于其他各組；精液保存5 d時，褪黑素濃度為20 mg/L的處理組精子線粒體活性高于對照組，且差異顯著(P<0.05)；褪黑素濃度為80 mg/L的處理組精子線粒體活性顯著低于對照組。

3 討 論

在正常的生命活動中，許多生理功能需要依賴自由基/活性氧(ROS)來執(zhí)行，因此自由基/活性氧(ROS)的存在必不可少。然而，Parrilla等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)含有過多ROS時，它會攻擊一些重要的生物大分子，導(dǎo)致生物機體損傷。呂逸清等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ROS與精子凋亡率呈正相關(guān),這是因為在羊的精液低溫保存中，ROS的含量會隨著保存時間的延長而增加，致使精子發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，影響精子的膜結(jié)構(gòu)和功能，使精子線粒體和DNA受到損傷[18]，這些損傷有可能會啟動細胞凋亡程序，使精子發(fā)生凋亡，進而影響精液低溫保存效果。本試驗通過在羊的精液稀釋液中加入不同濃度的抗氧化劑-褪黑素來研究對羊精液低溫保存效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羊精液稀釋液中添加適量濃度的褪黑素(20 mg/L)，可維持精子活力，提高精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性以及線粒體活性，從而提高羊精液低溫保存質(zhì)量。提示褪黑素在精液的低溫保存過程中能夠減少ROS產(chǎn)生，起到保護精子，延長精液的低溫保存時間的效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度褪黑素有利于提高精子保存品質(zhì)和保存時間，說明了添加抗氧化物的必要性。張?zhí)鞂毜萚19]發(fā)現(xiàn)低濃度褪黑素能夠促進抗凋亡蛋白Bcl2的表達，從而延長精子的保存時間。朱銀莉等[20]在豬常溫保存稀釋劑中添加褪黑素，結(jié)果表明褪黑素能夠延長精子的有效存活時間。在本試驗中，低濃度的褪黑素能夠提高山羊精液低溫保存質(zhì)量的試驗結(jié)果和上述研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，添加一定濃度(10 mg/L、20 mg/L、40mg/L)的褪黑素有利于提高精子保存品質(zhì)，能有效增加精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率以及線粒體活性，其中褪黑素濃度為20 mg/L時效果最好。但隨著添加褪黑素濃度的升高至80 mg/L，精子低溫保存效果下降明顯。

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