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        阿拉善型絨山羊精液稀釋液配方的篩選與優(yōu)化

        2018-03-29 03:06:06曲宏偉吳鐵成何云梅趙存發(fā)李玉榮趙生國(guó)
        家畜生態(tài)學(xué)報(bào) 2018年2期
        關(guān)鍵詞:活率阿拉善絨山羊

        曲宏偉,吳鐵成,何云梅,高 娃,趙存發(fā),李玉榮,劉 斌*,趙生國(guó)

        (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;3.內(nèi)蒙古蒙絨絨山羊產(chǎn)業(yè)研究院,內(nèi)蒙古 阿拉善 750306;4.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗家畜改良工作站,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯016100)

        阿拉善型絨山羊是荒漠草原牧區(qū)的主要畜種之一,具有適應(yīng)能力強(qiáng)、羊絨品質(zhì)好等特點(diǎn)。阿拉善型絨山羊羊絨細(xì)度在同類產(chǎn)品中獨(dú)具優(yōu)勢(shì),但其長(zhǎng)期生存在荒漠草原地區(qū),缺乏良好的管理?xiàng)l件,所以生產(chǎn)能力較低[1]。因此,為了提高該種羊的生產(chǎn)能力,增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值,就需要改進(jìn)生產(chǎn)方式。人工授精在現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展中已經(jīng)起到了重要角色并被大力推廣,精液稀釋是人工授精的一個(gè)重要技術(shù)環(huán)節(jié),原精經(jīng)過(guò)稀釋后,可大幅增加授精母羊的數(shù)量,提高種公羊的利用率[2]。目前,在山羊的人工授精技術(shù)方面,鮮精配種的效果要顯著優(yōu)于凍精[3],但鮮精保存的時(shí)間都不是很長(zhǎng)。所以擁有良好的精液稀釋液就顯得尤為重要。

        精液稀釋液需滿足精子必須的生存條件,延長(zhǎng)精子在體外存活的時(shí)間,增強(qiáng)精子活率,從而利于精子的保存和運(yùn)輸[4]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比幾種常用稀釋液對(duì)精液保存效果的差異,篩選出保存效果較好的稀釋液配方并進(jìn)行改進(jìn),通過(guò)篩選不同pH及不同蔗糖濃度的精液稀釋液對(duì)精子活率的影響,為精液的保存效果提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

        試驗(yàn)用精液采自阿拉善白絨山羊種羊場(chǎng)的3只配種用白絨山羊,年齡均為2歲,身體狀況良好。在配種期正常放牧,自由飲水,同時(shí)每只公羊每天補(bǔ)飼精料1.2~1.5 kg。

        1.2 試驗(yàn)藥品及器材

        葡萄糖,D-果糖,檸檬酸鈉,檸檬酸,EDTA,Tris,青霉素,卵黃,超純水,蔗糖,電子天平,燒杯,錐形瓶,顯微鏡,酸度計(jì),移液管。

        1.3 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

        2016年10月1日至2016年11月10日,在內(nèi)蒙古某白絨山羊種羊場(chǎng)配種期開(kāi)展試驗(yàn)。

        1.4 稀釋液配方

        試驗(yàn)初期所采用的4種配種常用精液稀釋液配方A1~A4來(lái)源于種羊場(chǎng)常用配方及陜北白絨山羊會(huì)議記錄,其配方成分見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)初次試驗(yàn)后,在所篩選的精液稀釋液配方的基礎(chǔ)上對(duì)其pH進(jìn)行調(diào)整,pH分別為6.7、6.5和6.3,其精液稀釋液配方B1~B3見(jiàn)表2。再次試驗(yàn)后,對(duì)所得出的最適pH的精液稀釋液配方進(jìn)行改進(jìn),改進(jìn)后的精液稀釋液配方C1~C3見(jiàn)表3。在稀釋液配制過(guò)程中,應(yīng)先將稱量好的藥品放入錐形瓶中,再加入100 mL超純水,最后加入青霉素,所有稀釋液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

        表1 生產(chǎn)上常用的4種精液稀釋液配方Table 1 Production of commonly used 4 kinds of semen diluent formula

        表2 不同pH的精液稀釋液配方Table 2 Different pH of semen diluent formula

        表3 改進(jìn)后的精液稀釋液配方Table 3 Improved semen diluent formula

        1.5 精液的采集與處理

        采用假陰道采集法進(jìn)行采精。將采到的精液在室溫下進(jìn)行活率檢測(cè),然后等量分裝于滅菌的離心管內(nèi),按照1∶4[2]加入相應(yīng)的精液稀釋液進(jìn)行稀釋,并編號(hào)標(biāo)記,然后將精液置于保溫桶內(nèi)(10~25 ℃)保存。每4~6 h翻動(dòng)一次離心管,防止精子沉淀。從稀釋完精液開(kāi)始,每6 h進(jìn)行一次活率檢測(cè),直至最后一份精液活率低于0.3為止。

        1.6 效果判定

        精子活率為視野中直線運(yùn)動(dòng)的精子占視野中總精子數(shù)的百分比;每次鏡檢精子活率,隨機(jī)觀察4個(gè)視野,檢測(cè)視野中直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例,求其平均值作為精子活率;每只羊三次重復(fù)。

        1.7 數(shù)據(jù)處理

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理后,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 常用精液稀釋液配方的篩選

        常用的4種精液稀釋液對(duì)精子活率的影響結(jié)果見(jiàn)表4,試驗(yàn)12 h之前4組精子活率差異不顯著(P>0.05)。18h~24 h,A2組與A3組活率顯著高于其他兩組(P<0.05)。36 h之后,A2組精子活率顯著(P<0.05)高于其他三組。

        2.2 不同pH對(duì)精子活率的影響

        不同pH精液稀釋液配方篩選結(jié)果見(jiàn)表5,試驗(yàn)6 h之前及30 h~42 h之間三組精子活率差異不顯著(P>0.05);在12 h~24 h之間及48 h~60 h之間B3組精子活率顯著高于其他兩組(P<0.05)。

        表4 不同稀釋液對(duì)精子活率的影響Table 4 Effects of different semen dilutions on sperm motility

        注:同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),不標(biāo)或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

        Note: Different letters in the same row indicate significant differences (P<0.05), no letter or the same letter indicate insignificant difference(P>0.05). The same below.

        表5 不同pH對(duì)精子活率的影響Table 5 Effects of different pH on sperm motility

        2.3 改進(jìn)后的精液稀釋液對(duì)精子活率的影響

        從表6可以看出,6 h之前三組精子活率差異不顯著(P>0.05);12 h~72 h之間C2組和C3組精子活率顯著高于C1組(P<0.05);而C2組和C3組之間差異不顯著(P>0.05)。

        2.4 三組配方中最優(yōu)組精子活率對(duì)比

        在圖1中,通過(guò)將三種精液稀釋液各組中最優(yōu)的一種配方效果進(jìn)行比較可見(jiàn),雖然短時(shí)間內(nèi)各稀釋液之間精子活率差異不明顯,但隨時(shí)間延長(zhǎng),優(yōu)化后的精液稀釋液中精子的活率及存活時(shí)間已明顯超過(guò)原精液稀釋液。

        圖1 三組配方中最優(yōu)組精子活率對(duì)比Fig.1 Comparison of sperm motility in optimal group of 3 groups

        保存時(shí)間/hStoragetime稀釋液SemendiluentC1C2C300.85±0.050.84±0.070.83±0.0760.81±0.070.84±0.070.83±0.06120.74b±0.050.81a±0.070.81a±0.05180.71b±0.050.80a±0.060.78a±0.06240.69b±0.050.78a±0.060.76a±0.07300.65b±0.050.74a±0.050.73a±0.07360.63b±0.080.72a±0.060.70a±0.07420.57b±0.090.68a±0.060.69a±0.08480.53b±0.080.68a±0.070.67a±0.10540.51b±0.070.64a±0.070.65a±0.09600.48b±0.060.63a±0.070.63a±0.08660.44b±0.080.58a±0.060.57a±0.07720.40b±0.070.52a±0.070.50a±0.07780.28±0.100.33±0.080.33±0.06840.09±0.140.11±0.160.09±0.14

        3 討 論

        精子活率是評(píng)價(jià)稀釋液效果的重要指標(biāo),是保證精子通過(guò)雌性生殖道并使卵子受精的重要條件[5],本次試驗(yàn)根據(jù)精子活率的情況,對(duì)四種不同的常用精液稀釋液效果進(jìn)行評(píng)定,可以看出A2組稀釋液的效果明顯要優(yōu)于其他各組稀釋液(P<0.05)。而將這四組常用稀釋液進(jìn)行pH測(cè)定后發(fā)現(xiàn)A2組的pH為6.5,其他三組分別為6.8,7.0,7.4,可以看出A2的pH相比其他三組偏酸性,從而以A2組稀釋液為基礎(chǔ),對(duì)其配方成份進(jìn)行pH優(yōu)化改進(jìn)。

        新鮮精液的pH一般為中性偏堿,當(dāng)pH低于這個(gè)范圍時(shí),精子的活動(dòng)及新陳代謝都會(huì)降低。大多數(shù)精液稀釋液中高濃度的葡萄糖能使pH降至6.0以下,這種酸性環(huán)境可以延長(zhǎng)精子的體外保存時(shí)間[6]。但是稀釋液中的pH超出一定的酸度范圍,則容易引起精子死亡,所以稀釋液中需添加適量的緩沖劑來(lái)調(diào)節(jié)pH[7]。而將EDTA作為緩沖劑加入稀釋液中,也有利于精子的保存[8]。在本次試驗(yàn)中,通過(guò)調(diào)節(jié)精液稀釋液的pH來(lái)觀察不同pH對(duì)精子活率的影響,發(fā)現(xiàn)pH為6.3的B3組的精子活率要優(yōu)于其他兩組(P<0.05),所以可以看出偏酸性的外界環(huán)境更容易保持精子活率及延長(zhǎng)山羊精子的存活時(shí)間,然后再以B3組稀釋液為基礎(chǔ),再進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)。

        糖類是精液稀釋液中的重要成分,精子主要通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生能量來(lái)維持細(xì)胞的新陳代謝及鞭毛運(yùn)動(dòng),這些能量主要是由稀釋液中的葡萄糖提供[9]。并且糖類還能夠在細(xì)胞的親水組織中替代水分子,這一特性在溫度變化過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞膜起到重要作用[10]。研究表明,高濃度的葡萄糖能夠提高精子活率,但是高濃度的蔗糖等雙糖對(duì)精子活率的提高也有作用[11]。本試驗(yàn)中,采用在篩選出的稀釋液中添加蔗糖對(duì)精液稀釋液進(jìn)行改進(jìn),其效果要優(yōu)于之前的稀釋液,尤其是蔗糖濃度為12 mg/mL和18 mg/mL的C2組和C3組,精子存活時(shí)間及精子活率均大于原稀釋液。有研究顯示,雖然蔗糖單獨(dú)添加于稀釋液對(duì)精子的保存效果較差,但與其他糖類混合后對(duì)于精子的保存效果要優(yōu)于未混合組[12],這與本次試驗(yàn)所得出的結(jié)論相同。因本次試驗(yàn)條件有限,只添加了蔗糖一種糖類進(jìn)行改進(jìn),若在稀釋液中再添加海藻糖等其他糖類,效果可能會(huì)更好,這有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

        本次試驗(yàn)結(jié)果與其他相關(guān)試驗(yàn)[3,13]相比,精子的保存時(shí)間及活率也有了較高的提升。為在草原牧場(chǎng)上更加高效的利用優(yōu)質(zhì)種公羊,提高精子活率和延長(zhǎng)精子保存時(shí)間是非常必要的。這對(duì)于草原上距離較遠(yuǎn)的羊場(chǎng)之間進(jìn)行人工授精提供了很大的方便,既不需要冷凍精液復(fù)雜的設(shè)備,又保障了所提供精子的活率。

        4 結(jié) 論

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,阿拉善型白絨山羊精液稀釋液的最佳pH為6.3,最優(yōu)蔗糖濃度為12~18 mg/mL。最優(yōu)配方為:葡萄糖3.00 g、檸檬酸鈉1.40 g、EDTA0.12 g、蔗糖1.8 g、青霉素20萬(wàn)U、卵黃10 mL,超純水100 mL。本次試驗(yàn)所在地處于偏遠(yuǎn)地區(qū),試驗(yàn)條件及設(shè)備有限,對(duì)精子的保存產(chǎn)生不利影響。但是從試驗(yàn)的整體效果來(lái)看,已經(jīng)起到了改進(jìn)常規(guī)精液稀釋液的目的,這將有利于阿拉善牧區(qū)絨山羊的人工授精及種公羊的利用率,對(duì)于較遠(yuǎn)距離羊場(chǎng)之間精液的運(yùn)輸和人工授精提供了可靠保障。

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