呂媛琳劉晨晨劉 慧張仙土喬 梁包劍鋒

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是目前最為常見的一種慢性肝病，其發(fā)病率在亞洲地區(qū)20年內(nèi)升高2%[1]。NAFLD以肝實質(zhì)細胞脂質(zhì)貯積和脂肪變性為特征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）[2-3]。目前我國非酒精性脂肪肝的發(fā)病率約為15%，是肝纖維化、肝硬化甚至是肝細胞癌的重要促進因素[4]。然而NAFLD的發(fā)病機制尚不明確，近年研究表明，胰島素抵抗與炎癥反應(yīng)在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。白細胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）是白細胞介素 1（IL-1）家族的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、肝胰島素抵抗等作用[7]。白細胞介素 6（interleukin 6，IL-6）作為炎癥介質(zhì)具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其濃度高低也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8]。研究[9]表明，IL-1β、IL-6 可以促進肝臟炎癥，誘發(fā)脂肪變性。大黃酸是中藥大黃的提取物，大黃具有清熱解毒、通腑瀉熱、活血消癰等功效。大黃可通過改善胰島素抵抗（insulin resistance，IR），糾正低脂聯(lián)素血癥和脂代謝紊亂等途徑，逆轉(zhuǎn)大鼠NAFLD的肝脂肪變性和肝功能異常[10]；可改善肝細胞脂肪變和炎性浸潤，減輕線粒體變形和腫脹[11]；采用不同劑量大黃素治療后，可顯著降低血脂和肝脂,改善肝功能[12]。本研究旨在觀察大黃酸對NAFLD干預(yù)作用及其對血清IL-1β、IL-6的影響。

1 實驗材料

1.1 動 物 雄性SD大鼠40只，動物合格證號：SCXK（滬）2013－0016。體質(zhì)量（200±20）g，清潔級，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，環(huán)境溫度18～20℃，濕度50%左右。

1.2 藥物及試劑 高脂飼料（貨號TP-2003，購自南通特洛菲飼料科技有限公司）；果糖（批號57-48-7，購自湖北賽創(chuàng)生物科技有限公司）；大鼠IL-6 Elisa試劑盒（批號L360014S，美國Bio-Rad）；大鼠IL-1βElisa試劑盒（批號 L474307S，美國 Bio-Rad）；大黃酸（批號NF-20151124，購自西安天豐生物科技有限公司）。

1.3 儀 器 1000mL燒杯：華東醫(yī)藥有限公司；37℃恒溫箱：日本日立公司；精密移液器及一次性吸頭：美國Bio-Rad；自動化酶免分析儀：鄭州安圖生物有限公司；離心機KUBOTA6200型：日本KUBOTA公司；日立7180全自動生化分析儀：日本日立公司；精密稱量儀：賽多利斯科學(xué)有限公司；低速離心機：上海安亭儀器有限公司；自動洗板機：日本KUBOTA公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 40只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，按體質(zhì)量隨機分為對照組10只，模型組20只，大黃酸組10只。對照組大鼠喂飼普通中性飼料（脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)分別提供13%、65%、22%的能量）+普通飲用水，模型組和大黃酸組大鼠喂飼高脂飼料（脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)分別提供45%、33%、22%的能量）+10%果糖水，造模8周。8周后，模型組處死10只HE染色，判斷造模是否成功。

2.2 給 藥 造模成功后，對照組和模型組大鼠分別給予生理鹽水10mg/kg灌胃，每天1次，大黃酸組予大黃酸100mg/kg灌胃，每天1次，連續(xù)給藥8周，實驗期間大鼠自由飲食。實驗過程中，由于灌胃操作不規(guī)范造成模型組與對照組大鼠死亡各1只。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般觀察 每周對大鼠體質(zhì)量、肝濕重、進食量及進水量進行測量和記錄，觀察各組大鼠皮毛光澤度，糞便，以及大鼠的精神狀態(tài)。

2.3.2 標本處理 16周后，末次給藥后禁食12h，3%戊巴比妥納30mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，無菌條件下解剖大鼠，腹主動脈取新鮮血液10mL，室溫靜置20min后分離血清，于超低溫離心機4℃，3000r/min，15min分離血清，取上清液，置-80℃，備用。

2.3.3 血生化指標及血清IL-1β、IL-6檢測 采用PHOMO自動化酶免分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alaninne aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（Total cholesterol，TG）、甘油三酯（triglycerides，TC）、空腹血糖（glucose，GLU）。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 測定血清白介素 1β（IL-1β）和血清白介素 6（IL-6）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況 給藥前，對照組行為活躍，反應(yīng)靈敏，食欲好，皮毛光整，無脫毛現(xiàn)象，體質(zhì)量穩(wěn)定增長，大便呈顆粒狀、色黃、質(zhì)硬。模型組體型肥胖，反應(yīng)遲鈍，皮毛蓬亂，毛色發(fā)黃，欠光澤，后期出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象、食欲減退，大便呈顆粒狀、色黑、質(zhì)硬。給藥后，大黃酸組體質(zhì)量下降，皮毛微黃，光澤可，脫毛少見，反應(yīng)較為靈敏，大便質(zhì)稀、不成型。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量和肝濕重比較 與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和肝濕重明顯增加（P＜0.05）;與模型組比較，大黃酸組大鼠體質(zhì)量和肝濕重明顯降低（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝濕重比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝濕重比較（g，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

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3.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6水平升高（P均＜0.05）。與模型組比較，大黃酸組大鼠血清IL-1β、IL-6水平降低（P均＜0.05），見表 2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6 水平比較（pg/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

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3.4 各組大鼠肝臟病理變化 對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無肝細胞腫脹及脂肪變性，匯管區(qū)無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝臟細胞呈大泡性脂肪變性為主的混合性脂肪性病變，可見氣球樣變，匯管區(qū)及肝竇出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和偶可見散在的點狀壞死；大黃酸組大鼠肝細胞脂肪變程度明顯減輕，肝細胞排列緊密，匯管區(qū)未見炎癥細胞浸潤。見圖1（插頁）。

3.5 各組大鼠血生化指標比較 與對照組比較，模型組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 明顯增加（P＜0.05）;與模型組比較，大黃酸組大鼠血清ALT、AST、TC、TG、GLU 明顯降低（P 均＜0.05），見表 3。

表 3 各組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 水平比較（±s）

表 3 各組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG、GLU 水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

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4 討論

中醫(yī)文獻中并無脂肪肝病名,但根據(jù)其發(fā)病特征和臨床表現(xiàn)及致病因素應(yīng)屬“肥氣”、“脅痛”、“積聚”、“脹滿”、“痰濁”、“黃疽”等范疇。其多由飲食膏粱厚味，脾失健運，肝腎陰虧，氣機瘀滯，血脈不暢而致。大黃具有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功效，而大黃酸是大黃的主要提取物，屬蒽醌類衍生物，具有瀉下、抑菌、止血、促進膽汁分泌、降脂、降壓和抗腫瘤作用[13]。近年研究[14-15]顯示，對脂肪肝、藥物性肝損傷等具有保護作用，同時可通過多個靶蛋白發(fā)揮抗炎作用。

本研究結(jié)果表明，大黃酸組體質(zhì)量、肝濕重較模型組明顯降低，且 ALT、AST、TC、TG、GLU 明顯降低（P＜0.05），提示大黃酸可以抑制肝臟脂質(zhì)沉積。而NAFLD的發(fā)病機制目前尚未明確，但胰島素抵抗（IR）與炎癥進展是其重要環(huán)節(jié)。IL-1β作為IL-1家族的一員，有研究表明在飲食誘導(dǎo)的肥胖模型中，IL-1β的表達可誘導(dǎo)肝臟炎癥和肝纖維化[16]。同時IL-1β可促進胰島β細胞的一氧化氮生成和細胞凋亡，從而選擇性破壞胰島β細胞導(dǎo)致IR，最終促進NAFLD發(fā)病[17]。本研究造模后，大鼠血清IL-1β明顯升高，而大黃酸干預(yù)后其表達明顯降低，提示大黃酸可能通過抑制IL-1β的表達從而達到減緩炎癥以及胰島素抵抗治療脂肪肝。

白介素6（IL-6）是預(yù)測或者導(dǎo)致胰島素抵抗的關(guān)鍵細胞因子[18]。研究[19]表明，IL-6在肥胖患者中的表達比BMI正?；颊吒?0%，提示IL-6可能參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。而IL-6可激活Shc/ERK信號通路、mTOR信號通路及PI3K/AKT信號通路，從而促經(jīng)炎癥反應(yīng)[20]。本研究造模后，大鼠血清IL-6明顯升高，大黃酸干預(yù)后其表達水平明顯降低（P<0.05），提示大黃酸可能通過抑制IL-6的表達從而達到減緩炎癥以及胰島素抵抗治療脂肪肝。

綜上所述，大黃酸可能通過抑制NAFLD大鼠血清IL-1β、IL-6表達，從而改善炎癥水平，減少脂質(zhì)沉積，改善肝臟脂肪變性。

［1］ Macavei B，Baban A，Dumitrascu DL.Psychological factors associated with NAFLD/NASH：a systematic review［J］.European Review for Medical&Pharmacological Sciences，2016，20（24）：5081-5097.

［2］ Nascimbeni F，Pais R，Bellentani S，et al.From NAFLD in clinical practice to answers from guidelines［J］.Journal of Hepatology，2013，59（4）：859.

［3］Pegah，Golabi，Cameron，et al.Effectiveness of exercise in hepatic fat mobilization in nonalcoholic fatty liver disease：Systematic review［J］.World Journal of Gastroenterology，2016，22（27）：6318-6327.

［4］董志霞，陸倫根.2015 JSGE非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎循證臨床實踐指南解讀［J］.中國醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版，2015，7（4）：19-22.

［5］ Tilg H，Diehl AM.Cytokines in alcoholic and nonalcoholic steatohepatitis［J］.New England Journal of Medicine，2000，343（20）：1467-1476.

［6］Fuchs CD，Traussnigg SA，Trauner M.Nuclear Receptor Modulation for the Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Disease［J］.Seminars in Liver Disease，2016，36（1）：69-86.

［7］ Tilg Herbert，Moschen Alexander R.IL-1 cytokine family members and NAFLD：neglected in metabolic liver inflammation［J］.Journal of hepatology，2011，55（5）：960-962.

［8］Nahandi MZ，Khoshbaten M，Ramazanzadeh E，et al.Effect of non-alcoholic fatty liver disease on carotid artery intimamedia thickness as a risk factor for atherosclerosis［J］.Gastroenterology&Hepatology from Bed to Bench，2014，7（1）：55-62.

［9］陳曉頂，范錄平，張有超，等.化滯柔肝顆粒對非酒精性脂肪肝脂聯(lián)素、IL-6、TNF-α 水平的影響［J］.中國生化藥物雜志，2017，37（2）：65-67.

［10］劉慶陽，高天舒，于世家.大黃酸改善大鼠非脂肪性肝病初步研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（7）：30-32.

［11］陸新烈，袁建芬，徐建立，等.大黃酸對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化的影響［J］.中國中醫(yī)藥科技，2013，20（5）：477-478.

［12］董慧，陸付耳，高志強，等.大黃素治療高脂飲食誘發(fā)的大鼠非酒精性脂肪肝的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（Z1）：64-67.

［13］陳秋荷，皮榮標，陳景考.大黃酸及其衍生物：合成與藥理作用研究進展［J］.藥學(xué)研究，2016，35（3）：161-167.

［14］武超，曹紅燕，孫明瑜.大黃酸在肝病中的應(yīng)用研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2015，43（12）：2382-2387.

［15］徐佑?xùn)|，張艷，孟憲麗，等.基于反向?qū)臃ǖ拇簏S酸抗炎作用的分子機制研究［J］.四川生理科學(xué)雜志，2016，38（1）：1-4.

［16］王傳敏，石慶鳳，湯守兵，等.乙型肝炎患者血清 IL-1β、γ-IFN、HA、LN和PCⅢ在肝炎肝纖維化時水平的變化及其意義［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，14（9）：718-721.

［17］王沖，程霖.初診糖尿病患者白介素-1β與胰島素抵抗的關(guān)系探討［J］.山東醫(yī)藥，2012，52（5）：86-87.

［18］沈璐.血清內(nèi)脂素、白介素6與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究［J］.中國航天工業(yè)醫(yī)藥，2013，15（12）：67-68

［19］Nassim DaliYoucef.Metabolic inflammation：Connecting obesity and insulin resistance［J］.Annals of Medicine，2013，45（3）：242-253.

［20］史冬梅，董方元，張帆，等.IL-6顯著調(diào)節(jié)亞油酸棕櫚酸聯(lián)合誘導(dǎo)脂肪肝細胞模型中脂代謝的通路表達［J］.世界華人消化雜志，2014，22（34）：5235-5241.