朱冰 張勇
關(guān)鍵詞:車前草;大車前苷;車前苷;高效液相色譜
中圖分類號:R917
文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A
車前草藥源豐富,價格低廉,具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒等功效,為車前科植物車前(Planttago asiatica)或平車前(P. depressa)的干燥全草?!吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定車前草的專屬性成分大車前苷為其主要藥用有效成分及其含量標(biāo)準(zhǔn)。大車前苷為苯乙醇苷類化合物,藥理研究表明苯乙醇苷類化合物具有利尿、抗炎、解痙等功效,與車前草的功效吻合。迄今為止,從車前草中分離鑒定的化合物還包括黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、多糖等。黃酮類化合物是車前草中另一主要活性成分,已建立了高效液相色譜法分析車前草中槲皮素、木犀草素、黃芩素等黃酮苷元的含量。車前苷具有抗氧化、蛋白激酶抑制等活性,是從車前草中分離并鑒定的一個黃酮類化合物,但尚未見其含量測定的研究報道。鑒于苯乙醇苷類和黃酮類化合物對車前草質(zhì)量評價和后繼開發(fā)利用的重要性,應(yīng)建立高效液相色譜法測定車前草中大車前苷和車前苷的含量,為車前草藥材及其臨床產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考,為車前草的進(jìn)一步合理開發(fā)提供依據(jù)。
1. 儀器與試劑
安捷倫1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies,Santa Clara,CA),包括四元泵、自動進(jìn)樣器、恒溫箱和二極管陣列檢測器。
車前草購于本地藥店,大車前苷標(biāo)準(zhǔn)品購自上海同田生物有限公司,車前苷標(biāo)準(zhǔn)品購自南京安美科技有限公司。色譜純甲醇和醋酸購自美國Fisher公司,其他分析純試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,水為超純水。
2.色譜條件
色譜柱:Waters Symmetry C18色譜
柱(250 mm × 4.6 mm i.d.);預(yù)柱:菲
羅門C18 (4.0 mm×3.0 mm,Phenomenex,
Torrance,CA)。流動相:溶劑A(0.4%醋酸水溶液)和溶劑B(甲醇),梯度洗脫過程為0~30 min,35%~45% B;流速:0.7 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:330 nm;進(jìn)樣量:20 μL。
3.車前草提取物溶液的制備
將車前草粉碎,精密稱取樣品100.00 g至圓底燒瓶中,用100 mL 70%的乙醇85℃回流提取三次,每次2 h,合并濾液過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏,得到7.40 g粗提物。精密稱取0.5 g 粗提物,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,用0.45 μm濾膜過濾得供試品溶液(50.0 mg/mL)。
1.色譜條件的選擇及優(yōu)化
大車前苷為苯乙醇苷類化合物,其紫外掃描最大吸收波長為254,300sh,330 nm;車前苷為黃酮類化合物,其紫外掃描最大吸收波長為285,332 nm。為了同時靈敏地檢測大車前苷和車前苷,選擇檢測波長為330 nm。
在測定大車前苷和車前苷時,考慮到兩種目標(biāo)化合物為多酚類化合物,在流動相中加入醋酸抑制酚羥基的離解。以甲醇–0.4%醋酸水、乙腈–0.4%醋酸水作為流動相,在不同梯度洗脫程序下的HPLC譜圖發(fā)現(xiàn),以乙腈–0.4%醋酸水作為流動相梯度洗脫時,目標(biāo)化合物與相鄰物質(zhì)基本分開,且目標(biāo)化合物峰形對稱性高。因此,在流速為0.7 mL/min時,選用0.4%醋酸水溶液(A)和甲醇溶液(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫: 0~30 min,35~45% B。色譜圖見下圖。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對比分析,主要化合物1和2被鑒定為大車前苷和車前苷。
2. 方法的線性范圍與檢出限
將大車前苷和車前苷的混合對照品儲備液用甲醇稀釋成5個濃度系列的混合對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液,在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析,記錄峰面積,以對照品濃度X (μg/mL)對其峰面積的平均積分值(Y)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及檢出限(S/N =3)(表1)。結(jié)果表明:大車前苷和車前苷因在5.0~250.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
3. 方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率
對同一混合對照品溶液重復(fù)測定6次,每次進(jìn)樣20 μL,測定峰面積,然后得大車前苷和車前苷的RSD分別為0.29 %、0.45 %,表明精密度良好;連續(xù)重復(fù)測定3天,大車前苷和車前苷峰面積的RSD分別為0.93 %、0.78 %,這說明對照品溶液在3天內(nèi)穩(wěn)定性良好;對同批樣品分別制備混合對照品,測定大車前苷和車前苷峰面積的RSD分別為0.38 %和0.41%,這表明同批次樣品重現(xiàn)性良好。
經(jīng)過測定,取綠原酸和咖啡因含量分別為38.51 μg/mL和52.83 μg/mL的車前草溶液3份,每份各1 mL,分別加入濃度為200.00 μg/mL的混合對照品溶液1 mL,混合的2 mL溶液,分別進(jìn)樣20 μL(結(jié)果見表2),回收率95.31%~104.70%,說明加標(biāo)回收率良好,準(zhǔn)確度高。
4. 樣品檢測
測定樣品3次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出大車前苷和車前苷的含量分別為2.85 ± 0.11mg/g和3.91 ± 0.18 mg/g。
本實驗首次建立了HPLC法同時測定車前草中車前苷和車前苷含量的方法,所建立的測定方法簡便、重復(fù)性好、精密度高,為車前草的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。
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