裴曉杭，張 茵，陳香麗，陳玉清，牛曉娜，張文薈

(河南省人民醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450003)

急性白血病(acute leukemia，AL)是一種來源于多能干細胞或早期祖細胞(髓系及淋系)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。在外源性毒物中苯是唯一較為明確的可致人類白血病的化學物質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人類造血干細胞通過芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)來維持其靜息、增殖及衰老[2]。苯等芳香烴類物質(zhì)是AHR的外源性配體。色氨酸二加氧酶(tryptophan 2，3-dioxygenase，TDO)是犬尿酸通路的首要限速酶之一，可將左旋色氨酸轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的犬尿氨酸(kynurenine，KYN)[3]。TDO廣泛表達于多種腫瘤細胞，并與人體抗腫瘤免疫應(yīng)答的減低有關(guān)[4]。OPITZ等[5]于2011年首次報道，在人類顱腦腫瘤中KYN可作為AHR的內(nèi)源性配體，通過 TDO-KYN-AHR通路抑制腫瘤免疫反應(yīng)，促進腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移，而且與腫瘤的進展和不良預后有關(guān)。目前尚無研究報道TDO、KYN及AHR在AL中的作用及其相關(guān)性。本研究通過觀察AHR mRNA和TDO mRNA在AL患者骨髓單個核細胞中的表達水平，并分析其相關(guān)性，旨在探討AL的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2013年8月至2014年8月河南省人民醫(yī)院收治的初診AL患者65例為觀察組，男38例，女27例，年齡16～83歲，中位年齡33歲，患者均符合法美英合作組(French-American-British cooperative group，F(xiàn)AB)關(guān)于AL的診斷標準[6]，其中急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)50例，急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)15例。MAL患者中男30例，女20例，年齡10～70歲，中位年齡40歲；ALL患者中男10例，女5例，年齡12～51歲，中位年齡39歲。另選擇同期因貧血就診的排除血液系統(tǒng)惡性疾病患者15例為對照組，其中男9例，女6例，年齡15～65歲，中位年齡36歲。AML、ALL及對照組患者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RQ-RT-PCR)儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，淋巴細胞分離液購自上海生工生物工程有限公司，RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒均購自美國Invitrogen公司。引物及探針序列由上海生工生物工程有限公司合成，AHR擴增片段為 183 bp，TDO擴增片段為192 bp。以β-actin作為內(nèi)參照，擴增片段為179 bp。AHR上游引物序列為5′-AACAGATGAGGAAGGAACAGAGC-3′，下游引物序列為5′-CTTAGAGTGGATGTGGTAGCAGAG-3′；TDO上游引物序列為5′-TAGAGCCAGCAAAGGAGGTC-3′，下游引物序列為5′-TTGGCAGAATTGAGTGCCTA-3′；管家基因actin上游引物序列為5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物序列為5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。

1.3骨髓采集及處理在無菌環(huán)境下，于初診時抽取觀察組及對照組患者髂后上嵴骨髓標本2 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝后于4 ℃冰箱保存，備用。

1.4RQ-RT-PCR檢測骨髓單個核細胞中AHRmRNA及TDOmRNA相對表達量取骨髓液 2 mL 混勻，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。最后加入30 μL 無RNA酶水進行溶解，并測定樣品總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶10 μL，模板2 μL，雙蒸水7.2 μL。PCR條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60個循環(huán)；60 ℃ 33 s，40個循環(huán)。擴增目的基因的同時擴增GAPDH基因。反應(yīng)結(jié)束后即可從RQ-PCR儀上直接獲得所需數(shù)據(jù)。采用相對定量法分析2組患者骨髓單個核細胞中AHR mRNA及TDO mRNA的相對表達量，靶基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.5統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行分析，mRNA表達量為非正態(tài)分布計量資料，采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-WallisH檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.12組患者骨髓單個核細胞中TDOmRNA、AHRmRNA表達水平比較結(jié)果見表1。觀察組中AML患者和ALL患者的骨髓單個核細胞中TDO mRNA、AHR mRNA表達顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AML患者與ALL患者骨髓單個細胞中TDO mRNA、AHR mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1初診AL患者骨髓單個核細胞中TDO和AHRmRNA表達水平

Tab.1ComparisonoftheexpressionofTDOmRNAandAHRmRNAinbonemarrowmononuclearcellsofpatientswithnewlydiagnosedAL

中位數(shù)(四分位數(shù)間距)

注：與對照組比較aP<0.05。

2.2AML、ALL患者骨髓單個核細胞中TDOmRNA與AHRmRNA的相關(guān)性AML和ALL患者骨髓單個核細胞中TDO mRNA與AHR mRNA表達均呈顯著正相關(guān)(r=0.801、0.922，P<0.05)。

2.3TDOmRNA、AHRmRNA與臨床實驗室指標的相關(guān)性50例初診AML患者的外周血白細胞計數(shù)為(52.9±18.3)×109L-1，血紅蛋白水平為(84.2±20.2)g·L-1，血小板計數(shù)為(49.0 ±23.0)×109L-1，乳酸脫氫酶水平為(1 055.5±530.4)U·L-1；15例初診ALL患者的外周血白細胞計數(shù)為(80.9±10.6)×109L-1，血紅蛋白含量為(71.2±25.3)g·L-1，血小板計數(shù)為(30.0±21.0)×109L-1，乳酸脫氫酶水平為(2 043.5±660.4)U·L-1。線性相關(guān)分析顯示，白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白及乳酸脫氫酶水平與TDO mRNA及AHR mRNA的表達均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2TDOmRNA、AHRmRNA與臨床實驗室指標的相關(guān)性

Tab.2CorrelationbetweentheexpressionofTDOmRNA，AHRmRNAandclinicallaboratoryindexesofALpatients

疾病類型nTDOmRNArPAHRmRNArPAML50 白細胞計數(shù)-0.1520.589-0.2310.408 乳酸脫氫酶-0.3050.269-0.2990.278 血紅蛋白0.0490.8620.1000.722 血小板計數(shù)-0.0150.958-0.0370.896ALL15 白細胞計數(shù)-0.1910.1830.0090.950 乳酸脫氫酶-0.1420.325-0.1150.428 血紅蛋白0.0120.9310.0140.922 血小板計數(shù)-0.0290.843-0.0920.526

3 討論

AHR是基本螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在細胞質(zhì)中可被其內(nèi)、外源性配體激活，移位到細胞核內(nèi)，并與AHR核轉(zhuǎn)運蛋白形成異二聚體復合物，此異二聚體可結(jié)合于相應(yīng)的DNA序列即AHR反應(yīng)元件，引發(fā)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，產(chǎn)生一系列生物學效應(yīng)[7]。AHR異常表達與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8]。多環(huán)芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)類物質(zhì)是一類毒性極高的環(huán)境持續(xù)污染物，當動物和人類偶然暴露于有毒的PAH時，PAH可與AHR結(jié)合后進入細胞核，形成異二聚體，誘發(fā)多種腫瘤[9]。研究表明，在缺乏環(huán)境型外源性配體PAH的情況下，AHR在很多腫瘤細胞如乳腺癌、肺腺癌、胃癌、成人T淋巴細胞淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和髓母細胞瘤中也是活躍和高表達的[10-17]，以上研究顯示，AHR不僅存在外源性配體，也存在相應(yīng)的內(nèi)源性配體，在外源性配體缺乏的情況下，內(nèi)源性配體激活AHR，從而誘發(fā)腫瘤。

已發(fā)現(xiàn)KYN為AHR的內(nèi)源性配體[18]，在人類腦腫瘤中，色氨酸經(jīng)TDO降解為KYN，KYN作為內(nèi)源性配體與其腫瘤細胞表達的AHR結(jié)合，由細胞質(zhì)進入細胞核，促使腫瘤細胞惡性增殖和侵襲[6]。KYN激活AHR以一種自分泌或旁分泌的方式促進腫瘤生長[19]。CASADO等[20]研究認為，AHR通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)異常的AHR信號和擾亂造血微環(huán)境參與了造血細胞的調(diào)節(jié)，并促進了包括AL在內(nèi)的血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究對50例AML患者和15例ALL患者的AHR mRNA表達進行檢測，AHR mRNA在AML患者和ALL患者中的表達均高于對照組，與CASADO等[20]研究一致，說明AHR mRNA的表達在AL的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。

KYN作為激活AHR的內(nèi)源性配體，在細胞內(nèi)主要由色氨酸轉(zhuǎn)化而來，參與色氨酸代謝的主要限速酶有吲哚胺2，3雙加氧酶和TDO。ADAMS等[21]研究顯示，人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的TDO-KYN-AHR通路是激活的，TDO mRNA和AHR mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中高表達。本研究顯示，TDO mRNA及AHR mRNA在AML和ALL患者骨髓單個核細胞中的表達均高于對照組，且AML、ALL患者骨髓單個核細胞中TDO mRNA與AHR mRNA的表達均呈顯著正相關(guān)，提示TDO-KYN-AHR通路不僅存在于人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中，也存在于AL患者。但進一步分析顯示，AML、ALL患者的TDO mRNA、AHR mRNA表達與白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)及乳酸脫氫酶水平等無顯著相關(guān)性，推測可能與樣本量小有關(guān)，進一步研究須在擴大樣本量的基礎(chǔ)上進行。

綜上所述，TDO和AHR在AL患者骨髓單個核細胞中呈高表達，TDO-KYN-AHR通路可能促進了AL的發(fā)生、發(fā)展，為免疫靶向治療TDO和AHR的靶點選擇提供了參考。

[1] 李君，王茂生，楊淑蓮，等.急性白血病1 040例臨床類型及發(fā)病相關(guān)因素構(gòu)成比分析[J].臨床血液學雜志，2011，24(3)：178-179.

[2] GASIEWICZ T A，SINGH K P，CASADO F L.The aryl hydrocarbon receptor has an important role in the regulation of hematopoiesis：implications for benzene-induced hematopoietic toxicity[J].ChemBiolInteract，2010，184(1/2)：246-251.

[3] MENG B，WU D，GU J，etal.Structural and functional analyses of human tryptophan 2，3-dioxygenase[J].Proteins，2014，82(11)：3210-3216.

[4] PILOTTE L，LARRIEU P，STROOBANT V，etal.Reversal of tumoral immune resistance by inhibition of tryptophan 2，3-dioxygenase[J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(7)：2497-2502.

[5] OPITZ C A，LITZENBURGER U M，SAHM F，etal.An endogenous tumour-promoting ligand of the human aryl hydrocarbon receptor[J].Nature，2011，478(7368)：197-203.

[6] 陸亞嵐，陳世明，汪玉芳，等.老年急性白血病患者染色體核型異常與FAB分型及預后的關(guān)系[J] 新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2015，32(9)：844-846.

[7] STEVENS E A，MEZRICH J D，BRADFIELD C A.The aryl hydrocarbon receptor：a perspective on potential roles in the immune system[J].Immunology，2009，127(3)：299-311.

[8] GASIEWICZ T A，HENRY E C，COLLINS L L.Expression and activity of aryl hydrocarbon receptors in development and cancer[J].CritRevEukaryotGeneExpr，2008，18(4)：279-321.

[9] PUGA A，MA C，MARLOWE J L.The aryl hydrocarbon receptor cross-talks with multiple signal transduction pathways[J].BiochemPharmacol，2009，77(4)：713-722.

[10] YANG X，SOLOMON S，F(xiàn)RASER L R，etal.Constitutive regulation of CYP1B1 by the aryl hydrocarbon receptor(AhR) in pre-malignant and malignant mammary tissue[J].JCellBiochem，2008，104(2)：402-417.

[11] PENG T L，CHEN J，MAO W，etal.Potential therapeutic significance of increased expression of aryl hydrocarbon receptor in human gastric cancer[J].WorldJGastroenterol，2009，15(14)：1719-1729.

[12] HAYASHIBARA T，YAMADA Y，MORI N，etal.Possible involvement of aryl hydrocarbon receptor(AhR) in adult T-cell leukemia(ATL) leukemogenesis：constitutive activation of AhR in ATL[J].BiochemBiophysResCommun，2003，300(1)：128-134.

[13] KOLIOPANOS A，KLEEFF J，XIAO Y，etal.Increased arylhydrocarbon receptor expression offers a potential therapeutic target for pancreatic cancer[J].Oncogene，2002，21(39)：6059-6070.

[14] GLUSCHNAIDER U，HIDAS G，COJOCARU G，etal.β-TrCP inhibition reduces prostate cancer cell growth via upregulation of the aryl hydrocarbon receptor[J].PLoSOne，2010，5(2)：e9060.

[15] ISHIDA M，MIKAMI S，KIKUCHI E，etal.Activation of the aryl hydrocarbon receptor pathway enhances cancer cell invasion by upregulating the MMP expression and is associated with poor prognosis in upper urinary tract urothelial cancer[J].Carcinogenesis，2010，31(2)：287-295.

[16] GRAMATZKI D，PANTAZIS G，SCHITTENHELM J，etal.Aryl hydrocarbon receptor inhibition downregulates the TGF-β/Smad pathway in human glioblastoma cells[J].Oncogene，2009，28(28)：2593-2605.

[17] DEVER D P，OPANASHUK L A.The aryl hydrocarbon receptor contributes to the proliferation of human medulloblastoma cells[J].MolPharmacol，2012，81(5)：669-678.

[18] NGUYEN L P，BRADFIELD C A.The search for endogenous activators of the aryl hydrocarbon receptor[J].ChemResToxicol，2008，21(1)：102-116.

[19] ANDERSSON P，MCGUIRE J，RUBIO C，etal.A constitutively active dioxin/aryl hydrocarbon receptor induces stomach tumors[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(15)：9990-9995.

[20] CASADO F L，SINGH K P，GASIEWICZ T A.The aryl hydrocarbon receptor：regulation of hematopoiesis and involvement in the progression of blood diseases[J].BloodCellsMolDis，2010，44(4)：199-206.

[21] ADAMS S，BRAIDY N，BESSEDE A，etal.The kynurenine pathway in brain tumor pathogenesis[J].CancerRes，2012，72(22)：5649-5657.