馮 麗，魏 洪，黃亞勵(lì)*，徐 紅，孫曉紅，蔣 靜

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 食品安全學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

獼猴桃（Actinidiadeliciosa）是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）的多年生落葉植物，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，有“水果之王、VC之王”的美稱，深受消費(fèi)者喜愛。截至2015年，貴州省修文縣獼猴桃種植面積達(dá)15萬hm2，“貴長(zhǎng)”獼猴桃為主栽品種，占90%以上[1]。獼猴桃皮薄汁多，是典型的呼吸躍變型果實(shí)，有明顯的生理后熟過程，果實(shí)易軟化，出現(xiàn)異味和霉?fàn)€，影響果實(shí)的貯藏、運(yùn)輸與銷售，限制了獼猴桃的產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2]。

國(guó)外報(bào)道的導(dǎo)致獼猴桃腐爛的主要病原菌是灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和擬莖點(diǎn)霉（Phomopsissp.），認(rèn)為病原菌先在衰老的花器上寄生，然后通過花端或在采收、分級(jí)、包裝過程中通過果蒂進(jìn)入果實(shí)內(nèi)[3-6]。王井田等[7]研究發(fā)現(xiàn)，“徐香”獼猴桃致腐爛病原菌是擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis sp.），該病菌潛伏在果園中，其侵染規(guī)律是菌絲體或者分生孢子器在發(fā)病的枝蔓、殘留的果梗和落葉落果上越冬，在下一年春季分生孢子借風(fēng)、雨水、昆蟲傳播，在謝花后的3周左右侵染幼果，謝花后6周左右侵染達(dá)到高峰，此后侵染達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，7月下旬開始第二次侵染。丁愛冬等[8]對(duì)“秦美”和“海沃德”獼猴桃的腐爛病原菌進(jìn)行研究，認(rèn)為病原菌在果園不是潛伏侵染的，采收運(yùn)輸時(shí)造成的機(jī)械傷口是主要的侵染途徑，未發(fā)現(xiàn)在果實(shí)過熟衰老前病原菌直接穿透果皮侵染。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)“貴長(zhǎng)”獼猴桃腐爛的病原菌及其侵染途徑研究較少。為了解“貴長(zhǎng)”獼猴桃腐爛的病原菌種類及其可能的侵染途徑，以其花、鮮果及腐爛果為研究對(duì)象，分離獼猴桃不同生長(zhǎng)階段所攜帶的真菌，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定，致病性試驗(yàn)確定主要致病菌，以期為延長(zhǎng)“貴長(zhǎng)”獼猴桃貯藏期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年5月至2017年1月，在貴州省修文縣獼猴桃基地（26.882 23°N，106.608 704°E，亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候），分別采集獼猴桃健康無病害的花和鮮果，部分鮮果在冷藏室貯藏形成腐爛果，品種為貴長(zhǎng)，分別進(jìn)行花、鮮果及腐爛果的真菌分離。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；瓊脂糖（agarose）G-10：法國(guó)BIOWEST公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程股份有限公司；2×EsTaqMasterMix、ddH2O、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；乳酸、苯酚、丙三醇（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；ITS1和ITS4引物：英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-B11·500-BY電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HH·W21·Cr600電熱恒溫水溫箱：北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；101-2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：浙江上虞市圣超儀器廠；WD-9413B凝膠成像分析儀：北京市六一儀器廠；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYY-7C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；TGL-16B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ci-e-ds-r11正置熒光顯微鏡：尼康儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃花、鮮果及腐爛果真菌的分離培養(yǎng)

獼猴桃花、鮮果、腐爛果分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%的酒精消毒，無菌水清洗后，用無菌剪刀將花剪碎成約0.5 cm×0.5 cm的組織塊；用滅菌刀片削去鮮果的果皮，果皮剪碎成約0.5 cm×0.5 cm的組織塊，再用滅菌鑷子挑取一定量的果肉組織；用滅菌刀片削去腐爛果果皮，用滅菌鑷子挑取一定量的病變組織；將各組織接種于PDA培養(yǎng)基上，每組重復(fù)3次，放置在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日，挑取不同形態(tài)的菌落于新的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次，得到純化的菌株，將純化的菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日，放于4℃保存?zhèn)溆肹9-10]。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

在載玻片上滴加1滴乳酸酚棉藍(lán)染色液（將20 mL乳酸、20 g苯酚、40 mL甘油、蒸餾水20 mL混勻，再加入50 mg棉藍(lán)），用接種針挑取少量菌落，置于載玻片上的染液中，用接種針分散菌絲。蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取試驗(yàn)菌株的總DNA，采用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增rDNA ITS序列，引物序列為ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反應(yīng)總體積50 μL：2×EsTaqMasterMix 25 μL，DNA 2 μL，ITS1/ITS4各2 μL，ddH2O 19 μL。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min，最后在4℃停止反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 V），DNA Marker指示分子質(zhì)量，30 min后在凝膠成像分析儀下檢測(cè)和照相。PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。獲得的序列遞交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national centerofbiotechnologyinformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4 致病性測(cè)定

將腐爛果分離純化后的菌株按照柯赫氏法則進(jìn)行回接驗(yàn)證，選取適齡的PDA平板菌落用打孔器制備直徑5 mm的菌餅，以刺傷的方式，將菌餅的菌絲面緊貼于表面消過毒的獼猴桃鮮果上，設(shè)置直徑5 mm的無菌培養(yǎng)基塊作對(duì)照。接種的獼猴桃放入25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，定期觀察發(fā)病情況并測(cè)量病斑直徑，根據(jù)病斑直徑大小判斷病菌致病性強(qiáng)弱。無致病性記為“-”，有致病性記為“+”，病斑直徑Φ≤5mm、5mm＜Φ≤10mm、10mm＜Φ≤15mm、15mm＜Φ≤20mm和Φ＞20mm時(shí)，病菌致病性分別用“+、++、+++、++++、+++++”表示，取發(fā)病的獼猴桃進(jìn)行病菌的分離鑒定[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

本試驗(yàn)從花中分離到6種菌株，分別記為H01、H02、H03、H04、H05、H06。從獼猴桃鮮果果肉中分離到1種菌株，果皮中分離到3種菌株，分別記為X01、X02、X03、X04。從腐爛果中分離到6種菌株，分別記為F01、F02、F03、F04、F05、F06。根據(jù)菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果見圖1～圖3。

由圖1可知，H01菌落正面白色，菌落背面可由白色變?yōu)辄S褐色，中心菌絲致密漸變成皮膜狀，邊緣絲毛狀，菌絲多分枝，有內(nèi)含物或中空，節(jié)狀分隔很多。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]，初步鑒定為多孔屬。H02菌落白色，絨毛狀，菌絲生長(zhǎng)旺盛，常多核，少有隔膜，常分枝，無鎖狀聯(lián)合。分生孢子為卵形顆粒。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14]，初步鑒定為平革菌屬。H03菌落黃白色，有皺紋，菌落邊緣為白色絨毛，背面為黃褐色，分生孢子頭球形或半球形，頂囊燒瓶狀，分生孢子球形或近球形。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15]，初步鑒定為曲霉屬。H04菌落灰綠色，邊緣為白色。菌落背面中心部位呈淺褐色，背面邊緣呈黃色，粉狀。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，頂端分枝呈掃帚狀，分生孢子呈球形或近球形。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[16]，初步鑒定為青霉屬。H05菌落橄欖綠色，背面黑綠色，平鋪狀，分生孢子多為單細(xì)胞，卵形、近球形、圓柱形，形成分枝的孢子鏈。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，初步鑒定為枝孢菌屬。H06菌落正面呈白色，背面呈黃白色，放射狀生長(zhǎng)，生成大量氣生菌絲，生長(zhǎng)迅速。產(chǎn)生大小兩種分生孢子，大分生孢子鐮刀形，小分生孢子多數(shù)單胞，卵形至長(zhǎng)圓形，單生，根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，初步鑒定為鐮刀菌屬。

圖1 獼猴桃花分離菌的菌落及顯微形態(tài)Fig.1 Colony and microscopic morphology of strains isolated from kiwi flower

圖2 獼猴桃鮮果分離菌的菌落及顯微形態(tài)Fig.2 Colony and microscopic morphology of strains isolated fromfresh kiwifruit

由圖2可知，X01菌落白色，絨毛狀，氣生菌絲旺盛邊緣整齊，背面呈微黃色，菌絲有間隔有分枝，鎖狀聯(lián)合明顯，菌絲粗細(xì)不均。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[17]，初步鑒定為裂褶菌屬。X02菌落初期白色，后期變?yōu)楹诨疑?，有同心輪紋，子囊孢子單細(xì)胞、暗色。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，初步鑒定為輪層炭殼屬。X03菌落絨狀，產(chǎn)孢子面黑綠色，背面黑色，分生孢子圓形，卵形，倒棍棒形，圓筒形，有縱橫隔膜0至多個(gè)。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，初步鑒定為鏈格孢屬。X04菌落正面灰綠色，菌落反面呈淡黃色，絮狀顆粒，分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)，上部有膨大頂囊，形如燒瓶，分生孢子球形。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15]，初步鑒定為曲霉屬。

圖3 獼猴桃腐爛果分離菌的菌落及顯微形態(tài)Fig.3 Colony and microscopic morphology of strains isolated fromrotten kiwifruit

由圖3可知，F(xiàn)01菌落生長(zhǎng)初期菌落正面呈白色，后期呈灰色甚至黑色，菌落背面呈墨綠色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲有隔，根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[20]，初步鑒定為小新殼梭孢。F02菌落正面中央為白褐色，背面中央黃褐色，邊緣為暗褐色，有輪狀生長(zhǎng)現(xiàn)象，分生孢子兩型，甲型分生孢子單胞，橢圓形或紡綞形，兩端各有1個(gè)油球；乙型分生孢子絲狀、鉤狀，單孢。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，初步鑒定擬莖點(diǎn)霉菌屬。F03菌落綠色，邊緣有白色絮狀，由圖3的N1、N2、N3和O1、O2、O3可見，F(xiàn)04和F05菌落青色，背面黃色，粉狀，分生孢子梗直立，頂端1至多次分枝呈掃帚形，分生孢子呈球形或近球形，分生孢子成串呈鏈狀。根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8，16]，初步鑒定為青霉屬。F06菌落正面呈白色短絨狀，背面為黃白色，菌絲生長(zhǎng)迅速，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量菌絲。大分生孢子呈鐮刀形，小分生孢子多數(shù)單胞，卵形至長(zhǎng)圓形，根據(jù)該真菌的形態(tài)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，初步鑒定為鐮刀菌屬。

2.2 rDNA-ITS分子鑒定

以基因組DNA為模板，對(duì)上述16株真菌的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖4。由圖4可知，其PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單一清晰條帶，分子質(zhì)量大約為500～750 bp。

圖4 16株真菌的rDNA ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.4 rDNA ITS amplification electrophoresis of 16 fungi strains

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，除去引物序列，獲得的16株分離真菌的rDNA ITS序列長(zhǎng)度分別為574 bp（H01）、584 bp（H02）、482 bp（H03）、470 bp（H04）、474 bp（H05）、479 bp（H06）、553 bp（X01）、505 bp（X02）、479 bp（X03）、518 bp（X04）、501 bp（F01）、495 bp（F02）、508 bp（F03）、507 bp（F04）、509bp（F05）和465bp（F06），菌株序列提交到 NCBI GenBank中注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：MF491816～MF491831），并與GenBank中已有序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，除了菌株F04和F05，其他菌株分別與漏斗多孔菌（Polyporusarcularius）（KP283489.1）、平革菌屬（Phanerochaetesp.）（DQ912697.1）、曲霉屬（Aspergillussp.）（KX688043.1）、橘青霉（Penicillium citrinum）（NR_121224.1）、枝孢菌屬（Cladosporiumsp.）（KX378909.1）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）（KT270215.1）、裂褶菌（Schizophyllum commune）（LT217533.1）、蔡氏輪層炭殼菌（Daldinia childiae）（KU683757.1）、鏈格孢菌（Al ternariasp.）（KY077525.1）、煙曲霉（Aspergillus fumigates）（KX064986.1）、小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）（KX871881.1）、擬莖點(diǎn)霉（Phomopsissp.）（AB302243.1）、Penicillium paneum（HQ442339.1）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（KF889114.1）相似性為99%～100%。根據(jù)相似序列搜索結(jié)果，提取相似性高的已知菌株的ITS區(qū)基因序列，與試驗(yàn)菌株序列一起用Clustalx1.83軟件進(jìn)行匹配排列，用MEGA6軟件以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用1 000次重復(fù)的自展檢驗(yàn)進(jìn)化樹枝的置信度[21]。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

由圖5可知，結(jié)合分離菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果，將菌株H01鑒定為漏斗多孔菌（Polyporus arcularius）、菌株H02為平革菌屬（Phanerochaetesp.）、菌株H03為曲霉屬（Aspergillussp.）、菌株H04為橘青霉（Penicillium citrinum）、菌株H05為枝孢菌屬（Cladosporiumsp.）、菌株H06為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、菌株X01為裂褶菌（Schizophyllum commune）、菌株X02為蔡氏輪層炭殼菌（Daldinia childiae）、菌株X03為鏈格孢菌（Alternariasp.）、菌株X04為煙曲霉（Aspergillus fumigates）、菌株F01為小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、菌株F02為擬莖點(diǎn)霉（Phomopsissp.）、菌株F03為Penicillium paneum、菌株F06為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。菌株F04和F05根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)可以將其鑒定為青霉屬，但是不能鑒定到具體的菌種，具體的鑒定有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 基于ITS-rDNA基因序列真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of fungi based on ITS-rDNA gene sequence

2.3 致病性測(cè)定結(jié)果

表1 6種真菌分離物接種獼猴桃果實(shí)后的致病情況Table 1 Pathogenicity of 6 fungal isolates on fruits of kiwifruit

將獼猴桃腐爛果分離到的病原菌以菌餅的形式刺傷接種于健康的獼猴桃果面，以直徑5 mm的無菌培養(yǎng)基塊作對(duì)照（CK），致病性結(jié)果見表1。由表1可知，從獼猴桃腐爛果中分離到的6株真菌均能引起獼猴桃腐爛，其中F01小新殼梭孢菌、F02擬莖點(diǎn)霉具有的致病性最強(qiáng)。對(duì)發(fā)病的獼猴桃進(jìn)行再分離，獲得了與原接種菌形態(tài)特征一致的病菌，符合柯赫氏法則要求。

3 結(jié)論

從貴長(zhǎng)腐爛獼猴桃中分離出6株菌，鑒定4株菌，分別是小新殼梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、擬莖點(diǎn)霉（Phomopsissp.）、Penicillium paneum及尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），有2株菌鑒定為青霉屬（Penicilliumsp.），具體的鑒定有待進(jìn)一步研究。根據(jù)致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為小新殼梭孢菌和擬莖點(diǎn)霉是導(dǎo)致貴長(zhǎng)獼猴桃腐爛的主要病原菌。已有研究報(bào)道在貴長(zhǎng)獼猴桃的腐爛果中分離到擬莖點(diǎn)霉[9]。小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）曾被認(rèn)為是葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva）的無性階段Fusicoccum parvum[22]。后有研究者通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)建立了一個(gè)新屬Neofusicoccum，將F.parvum轉(zhuǎn)屬重組為該屬的模式種[23]。

本研究從獼猴桃花中分離鑒定出6株菌，漏斗多孔菌、平革菌屬、曲霉屬、橘青霉、枝孢菌屬及鐮刀菌屬；鮮果果肉中分離到1株菌，裂褶菌；鮮果果皮中分離到3株菌，分別為蔡氏輪層炭殼菌、鏈格孢菌和煙曲霉?；ê王r果中均未分離到引起獼猴桃腐爛的病原菌，由此推測(cè)，獼猴桃腐爛果的病原菌沒有在花期和鮮果期潛伏存在，獼猴桃病原菌的侵染途徑可能主要是通過采收、運(yùn)輸和包裝過程中進(jìn)入獼猴桃內(nèi)，從而引起獼猴桃的腐爛，病原菌浸染途徑的結(jié)論與丁愛冬等[8]研究結(jié)論一致，但是與王井田等[7]研究結(jié)論不同，病原菌侵染途徑的不同可能與獼猴桃的品種、生長(zhǎng)的環(huán)境等有關(guān)，需要進(jìn)行更深入地研究。

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