陸 敏，肖 敏，周景瑞，吳擁軍*

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省貴陽市云巖區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局，貴州 貴陽 550004；3.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽 550016；4.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

火龍果屬于典型的熱帶、亞熱帶水果，因其外皮鱗片酷似蛟龍的外鱗以及明亮的紅色而得名[1]，在我國(guó)的廣西省、廣東省、海南省、浙江省、福建省、云南省、貴州省均有種植[2]?；瘕埞鉅I(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，具有較高的維生素、膳食纖維素、磷脂，豐富的碳水化合物、有機(jī)酸、植物蛋白、礦物質(zhì)及甜菜紅素，而且具有低脂肪、低熱量等特點(diǎn)[3-8]，使其具有良好的加工特性。主要加工產(chǎn)品包括果汁、果醬、果凍、果脯、果糖、酸奶、冰淇淋、果酒、果醋、罐頭等[9]。

果醋作為一種集營(yíng)養(yǎng)、保健、食療等功能為一體的新型食用調(diào)味品和飲料[10-12]，近年來在我國(guó)發(fā)展迅速，具有較好的市場(chǎng)前景。但相較于日本等先進(jìn)國(guó)家，我國(guó)的果醋生產(chǎn)存在果醋生產(chǎn)規(guī)模小、果醋品種差且單一、果醋通用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未出臺(tái)、果醋的消費(fèi)意識(shí)和消費(fèi)量有待提高等問題[13]，而且目前真正投入生產(chǎn)的果醋品種較少，主要有葡萄果醋[14]、蘋果醋[15]等，紅心火龍果醋的研究相對(duì)較少。寧恩創(chuàng)等[16]研究了火龍果果醋的生產(chǎn)工藝為起始酒精度6%vol，糖度5%，酵母菌接種量10%，30℃恒溫發(fā)酵6 d；沈曉怡等[17]研究確定的紅心火龍果營(yíng)養(yǎng)果醋醋酸發(fā)酵最佳工藝條件為起始酒精度6%vol，醋酸菌接種量10%，33℃恒溫發(fā)酵6 d。

近年來，貴州省大面積引進(jìn)紅心火龍果種植，針對(duì)貴州紅心火龍果產(chǎn)量大，鮮果上市相對(duì)集中，保質(zhì)期較短等問題。為提高紅心火龍果的附加值，本研究以貴州關(guān)嶺生產(chǎn)的紅心火龍果為原料，對(duì)發(fā)酵型紅心火龍果醋的加工工藝進(jìn)行探索，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其生產(chǎn)工藝，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行30 L果醋發(fā)酵罐放大試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為紅心火龍果的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考及紅心火龍果醋的工業(yè)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅心火龍果原果酒：貴州省關(guān)嶺縣火龍果種植基地紅心火龍果釀造所得；光明牌釀醋醋酸菌：上海佳民釀造食品有限公司；迪發(fā)牌釀醋醋酸菌：上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司；LB1醋酸菌種：福建永春醋廠；蔗糖（食品級(jí)）、飲用水：市售；冰醋酸（食品級(jí)）：湖北鑫潤(rùn)德化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX53顯微鏡：奧林巴斯有限公司；QYC-200恒溫?fù)u床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JCC-30L果醋發(fā)酵罐：福建省永春金春釀造有限公司；YX-280B手提式滅菌鍋：廣州康邁醫(yī)療器械有限公司；0～100%酒精計(jì)：河北省武強(qiáng)縣華鷗儀器儀表廠；Mode1828奧立隆pH計(jì)：德國(guó)Thermo上海分公司；JOANLAB酸堿滴定管：寧波鄞州群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅心火龍果醋搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)工藝流程

紅心火龍果原果酒→酒精度調(diào)整→接種醋酸菌→醋化→陳釀→過濾→澄清→過濾→紅心火龍果原果醋

操作要點(diǎn)：

原料：九成熟新鮮紅心火龍果經(jīng)酒精發(fā)酵（按實(shí)驗(yàn)室前期得到的酒精最佳釀造工藝）至酒精度≥13%vol，陳釀30 d過濾后得火龍果原果酒。

酒精度調(diào)整：按照一定比例添加飲用水調(diào)整原果酒酒精度至5%vol～9%vol作為果醋發(fā)酵的初始酒精度。

醋酸發(fā)酵：無菌環(huán)境加入一定量活化后的醋酸菌種（果酒體積8%～12%），四層已滅菌醫(yī)用紗布封口，于30℃、180 r/min搖床振蕩發(fā)酵，當(dāng)酸度不變時(shí)，終止發(fā)酵。

果醋陳釀：將紅心火龍果醋在10～15℃條件下陳釀40～60 d，能改善果醋風(fēng)味和澄清醋液。

過濾：陳釀好的紅心火龍果醋經(jīng)400目濾布過濾，注意適時(shí)更換濾布。

澄清：過濾后果醋在室溫條件下澄清20～30 d，再次取上清液用400目濾布過濾得紅心火龍果原果醋。

1.3.2 醋酸菌種的選擇

將光明牌、迪發(fā)牌釀醋醋酸菌和LB1醋酸菌種在180r/min、32℃條件下培養(yǎng)24～36h，當(dāng)菌液酸度在2g/100mL以上時(shí)，即為醋酸菌種子液。加入果酒體積10%的醋酸菌種子液，表面拌勻，蓋上塑料薄膜，分別進(jìn)行紅心火龍果醋發(fā)酵試驗(yàn)，以果醋酸度及感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定適宜的發(fā)酵菌種。

1.3.3 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)

從初始酒精度、接種量、初始pH、發(fā)酵溫度4個(gè)方面進(jìn)行紅心火龍果醋發(fā)酵單因素試驗(yàn)。設(shè)置火龍果酒初始酒精度分別為5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol；火龍果酒初始pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；醋酸菌種接種量分別為8%、9%、10%、11%、12%；發(fā)酵溫度26℃、28℃、30℃、32℃、34℃。采用單一變量法試驗(yàn)，發(fā)酵完成后對(duì)各組果醋進(jìn)行酸度的測(cè)定。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化醋酸發(fā)酵試驗(yàn)條件

在單因素的試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定醋酸發(fā)酵階段影響紅心火龍果醋產(chǎn)酸量及感官品質(zhì)的主要影響因素分別為：初始pH（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、初始酒精度（D）。以4個(gè)重要影響因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化，因素與水平如表1所示。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 30 L果醋發(fā)酵罐放大試驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵工藝條件下，實(shí)驗(yàn)室采用小型自吸式果醋發(fā)酵罐，進(jìn)行30 L紅心火龍果醋發(fā)酵放大試驗(yàn)，為紅心火龍果醋工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1.3.6 火龍果醋感官評(píng)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》中感官指標(biāo)要求，結(jié)合紅心火龍果醋自身特點(diǎn)，對(duì)紅心火龍果醋進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，滿分100分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 紅心火龍果醋感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of red pitaya vinegar

1.3.7 檢測(cè)方法

酒精度、酸度（以醋酸計(jì)g/100 mL）：按照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》規(guī)定的酒精計(jì)法及電位滴定法測(cè)定；細(xì)菌總數(shù)：按國(guó)標(biāo)GB/4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》規(guī)定方法測(cè)定；大腸菌群：按照國(guó)標(biāo)GB/4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中規(guī)定方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌種的確定

不同醋酸菌種發(fā)酵過程中果醋酸度的變化如圖1所示。由圖1可知，三種醋酸菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)酸規(guī)律一致，隨著發(fā)酵時(shí)間增加酸度先增加后趨于平穩(wěn)，其中LB1醋酸菌種產(chǎn)酸量最高，發(fā)酵速度快。三種菌種發(fā)酵周期存在一定的差異，LB1醋酸菌種發(fā)酵周期較光明牌和迪發(fā)牌菌種短。產(chǎn)酸能力由大到小依次為L(zhǎng)B1醋酸菌種＞光明牌＞迪發(fā)牌。LB1醋酸菌種產(chǎn)酸明顯高于其余兩個(gè)菌種，酸度最高達(dá)5.29 g/100 mL，光明牌產(chǎn)酸略高于迪發(fā)牌。

圖1 不同醋酸菌種醋酸發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Results of acetic acid fermentation with different acetic acid bacteria

對(duì)不同醋酸菌種發(fā)酵所得火龍果醋進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。

表3 不同醋酸菌種發(fā)酵紅心火龍果醋感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Results of sensory evaluation of red pitaya vinegar with different acetic acid bacteria

由表3可知，三種不同菌種產(chǎn)酸存在較大的差異，經(jīng)LB1醋酸菌種發(fā)酵得到的紅心火龍果醋醋香濃郁，口感柔和，評(píng)分最高，為89分；迪發(fā)牌醋酸菌發(fā)酵果醋酸味柔和，但口感偏澀，稍差；光明牌醋酸菌發(fā)酵果醋口感最差，刺激性較強(qiáng)。因此，選用LB1醋酸菌種作為紅心火龍果醋的醋酸菌種。

2.2 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.2.1 初始酒精度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響

考察不同初始酒精度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 初始酒精度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on red pitaya vinegar fermentation

由圖2可知，在發(fā)酵初期，初始酒精度對(duì)紅心火龍果醋酸度影響不大；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，初始酒精度越高，紅心火龍果醋酸度逐漸升高；當(dāng)初始酒精度＞8%vol時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酸速率與產(chǎn)酸量開始下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)初始酒精度較低時(shí)，醋酸菌能利用物質(zhì)的較少，產(chǎn)酸量較少，生產(chǎn)效率低；而過高的酒精度對(duì)醋酸菌種繁殖代謝具有一定抑制作用，會(huì)降低其代謝活力，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，降低產(chǎn)酸量。當(dāng)初始酒精度為8%vol時(shí)醋酸發(fā)酵效率較高、發(fā)酵周期較短，因此確定初始酒精度為8%vol。

2.2.2 初始pH對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響

考察不同初始pH值對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 初始pH對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial pH on red pitaya vinegar fermentation

由圖3可知，隨著初始pH值的增加，紅心火龍果醋酸度呈先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)紅心火龍果酒發(fā)酵液初始pH值為4.0時(shí)，酸度達(dá)到最高為5.28 g/100 mL；繼續(xù)增加初始pH值，則發(fā)酵液酸度開始降低，這是由于較高的初始pH值不利于醋酸菌種的生長(zhǎng)，影響了發(fā)酵產(chǎn)酸量。當(dāng)紅心火龍果酒初始pH值在3.5～4.5范圍內(nèi)，對(duì)果醋發(fā)酵產(chǎn)酸量影響較小，因此確定調(diào)整紅心火龍果酒發(fā)酵液初始pH值在3.5～4.5范圍內(nèi)進(jìn)行果醋發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2.3 接種量對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響

考察不同接種量對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 接種量對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of inoculum on red pitaya vinegar fermentation

由圖4可知，當(dāng)接種量在8%～10%范圍內(nèi)，隨著接種量增加，對(duì)應(yīng)果醋發(fā)酵周期縮短；當(dāng)接種量為10%時(shí)，果醋發(fā)酵速率快，產(chǎn)酸量高；而接種量為8%或12%時(shí)，果醋的發(fā)酵速率明顯低于10%的醋酸菌接種量。接種量過少，果醋發(fā)酵初期菌體量不夠，產(chǎn)酸能力弱，發(fā)酵不完全，且易受雜菌污染，不利于果醋規(guī)模化生產(chǎn)；當(dāng)接種量過大時(shí)，果酒發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于醋酸菌菌體生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)產(chǎn)生大量的代謝廢物，使醋酸菌種提前進(jìn)入老化階段、發(fā)生自溶現(xiàn)象，從而影響果醋發(fā)酵產(chǎn)酸量及果醋品質(zhì)。因此，選擇LB1醋酸菌種接種量為10%進(jìn)行紅心火龍果醋發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響

考察不同發(fā)酵溫度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of temperature on red pitaya vinegar fermentation

由圖5可知，在發(fā)酵溫度28～32℃范圍內(nèi)，醋酸菌種發(fā)酵速度較快，產(chǎn)酸量高，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，紅心火龍果醋酸度達(dá)到最高為5.29 g/100 mL。由于生物機(jī)體內(nèi)酶活性與環(huán)境溫度具有一定相關(guān)性，生產(chǎn)過程中應(yīng)合理控制環(huán)境溫度，促進(jìn)生物機(jī)體進(jìn)行生產(chǎn)和代謝產(chǎn)物。發(fā)酵溫度對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)、繁殖及代謝速率具有重要的影響，過低或過高的環(huán)境溫度都不利于醋酸菌種的發(fā)酵。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度升高，醋酸菌代謝活躍，縮短醋酸發(fā)酵周期；當(dāng)發(fā)酵溫度升高到一定程度時(shí)，醋酸菌種提前進(jìn)入老化階段，從而導(dǎo)致產(chǎn)酸量降低。因此，確定紅心火龍果醋發(fā)酵溫度為30℃。

2.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化紅心火龍果醋發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵工藝進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 紅心火龍果醋發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of red pitaya vinegar fermentation

由表4可知，影響紅心火龍果醋發(fā)酵主次因素順序?yàn)镈＞B＞A=C，即初始酒精度＞發(fā)酵溫度＞初始pH值=接種量。紅心火龍果醋發(fā)酵工藝最優(yōu)方案為A2B2C2D2即，初始pH值4.0，發(fā)酵溫度30℃，LB1醋酸菌種接種量10%，初始酒精度8%vol。在此工藝條件下，發(fā)酵所得紅心火龍果醋酸度為5.30 g/100 mL。沈曉怡等[17]在初始酒精度為6%vol、AS1.41醋酸菌種接種量10%、33℃恒溫發(fā)酵6 d的條件下，所得火龍果醋酸度為3.63 g/100 mL，較本實(shí)驗(yàn)工藝條件下酸度低1.67 g/100 mL，說明實(shí)驗(yàn)所得紅心火龍果工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)具有可推廣意義。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表5可知，初始酒精度對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他3個(gè)因素對(duì)果醋發(fā)酵結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），這與表4極差分析結(jié)果一致，由于醋酸菌自身對(duì)環(huán)境的溫度、酸堿度就有一個(gè)耐受范圍，合理范圍內(nèi)溫度、酸堿度的的波動(dòng)對(duì)其自身的生長(zhǎng)、繁殖和代謝沒有太大影響，則對(duì)最終發(fā)酵結(jié)果影響不大；醋酸菌9%～11%的接種量本身也屬于正常合理范圍，對(duì)菌體產(chǎn)酸能力沒有太大影響。

2.2.6 紅心火龍果醋發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交優(yōu)化試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行火龍果醋發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次。3次試驗(yàn)果醋酸度分別為5.30 g/100 mL、5.30 g/100 mL、5.31 g/100 mL，平均值為5.30 g/100 mL，與正交試驗(yàn)結(jié)果相吻合，故正交試驗(yàn)結(jié)果可行。

2.3 30 L果醋發(fā)酵罐放大試驗(yàn)

醋酸菌為嚴(yán)格好氧菌，因此通氣量對(duì)發(fā)酵效率具有重要的影響。通氣量過大會(huì)帶走大量的酒精和醋酸，影響醋酸發(fā)酵過程的進(jìn)行，而通氣量過小，醋酸菌會(huì)出現(xiàn)缺氧情況，醋酸菌會(huì)出現(xiàn)大量死亡情況，這對(duì)于酷酸發(fā)酵過程的進(jìn)行是十分不利的。有關(guān)研究表明[18]，液體深層米醋發(fā)酵過程中，酸生成速度為0.1 g/（100 mL·h）時(shí)，每升發(fā)酵液的通氣量為0.1 mL/（mL·min）能滿足正常發(fā)酵。余永建等[18]對(duì)桑葚果醋生產(chǎn)工藝的研究發(fā)現(xiàn)100 L的發(fā)酵罐取通氣量為0.15 mL/（mL·min）時(shí)比較適合桑葚果醋的發(fā)酵。結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況，最終調(diào)整通氣量為（0.16±0.02）m3/h。按照實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵最佳工藝參數(shù)進(jìn)行30 L果醋發(fā)酵放大試驗(yàn)，得到的紅心火龍果醋呈淡琥珀色、澄清透明、無肉眼可見沉淀及懸浮物、有清淡的火龍果香味、酸甜爽口，柔和無異味，各項(xiàng)理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合相應(yīng)國(guó)標(biāo)要求。結(jié)果表明，3次酸度分別為6.32 g/100 mL、6.34 g/100 mL、6.36 g/100 mL，平均酸度為6.34 g/100 mL，較搖瓶發(fā)酵酸度增加1.04 g/100 mL，分析放大試驗(yàn)酸度增加的原因主要由于兩種試驗(yàn)醋酸發(fā)酵過程中供氧方式發(fā)生根本性改變。

3 結(jié)論

本研究采用正交試驗(yàn)對(duì)紅心火龍果醋發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定紅心火龍果醋發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為：初始酒精度8%vol，初始pH值4.0，LB1醋酸菌種接種量10%和發(fā)酵溫度30℃。在此工藝條件下，發(fā)酵所得紅心火龍果醋酸度為5.30 g/100 mL，感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)均符合相關(guān)國(guó)標(biāo)，得到的紅心火龍果醋為淡琥珀色、澄清透明、無肉眼可見沉淀及懸浮物、有清淡的火龍果香味、酸甜爽口柔和，無異味。30 L果醋發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，最終酸度達(dá)6.34 g/100 mL，初步確定發(fā)酵型紅心火龍果醋工業(yè)生產(chǎn)工藝條件，為貴州紅心火龍果的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了參考，為火龍果醋的工業(yè)生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)及實(shí)際意義。

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