趙淑琴，楊孝樸

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，種類繁多，按水解產(chǎn)物異構(gòu)類型的差異可將淀粉酶分為α-淀粉酶和β-淀粉酶，其中α-淀粉酶應(yīng)用最為廣泛。淀粉酶是迄今為止最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)酶、產(chǎn)量最大、使用用途最廣的酶制劑品種[1]，目前大多以微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[2]。淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、淀粉糖漿、傳統(tǒng)釀造、紡織業(yè)、青儲(chǔ)飼料、醫(yī)藥等行業(yè)[3-4]。然而，在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的高溫、酸堿度和重金屬離子等苛刻的使用環(huán)境中，淀粉酶的穩(wěn)定性會(huì)迅速下降，酶的活力也會(huì)損失較快或完全喪失，使用壽命及效率也會(huì)隨之降低，從而使淀粉酶的應(yīng)用范圍縮小，阻礙了淀粉酶的應(yīng)用與發(fā)展。由于我國(guó)淀粉資源豐富，淀粉酶的應(yīng)用范圍廣泛，淀粉酶工業(yè)發(fā)展與我國(guó)其他工業(yè)的發(fā)展有著緊密的聯(lián)系，推動(dòng)淀粉酶工業(yè)的發(fā)展，也將推動(dòng)我國(guó)其他工業(yè)的共同發(fā)展[5]。因此，進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)淀粉酶的產(chǎn)量和品種研究，開(kāi)發(fā)具有高穩(wěn)定性的淀粉酶以更好的適應(yīng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展需要[6]，使淀粉酶可以適應(yīng)高溫、強(qiáng)酸堿等苛刻的工業(yè)環(huán)境條件[7]，是近年來(lái)待解決的重要課題[8]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)淀粉酶的開(kāi)展了大量的研究。劉金嵐等[9]以大腸-枯草穿梭載體pMA5質(zhì)粒為骨架，以嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）NUB3621的耐高溫α-淀粉酶基因?yàn)槟康幕?，利用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（prolonged overlap extension polymerase chain reaction，POE-PCR）成功構(gòu)建了針對(duì)淀粉酶的信號(hào)肽篩選載體。楊韻霏等[10-11]通過(guò)木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)地衣芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的高效異源表達(dá)，并對(duì)重組枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，酶活最高達(dá)到296.64U/mL發(fā)酵液，從而提高麥芽糖淀粉酶在工業(yè)中的應(yīng)用。因此，該研究從富含淀粉的地方采集土樣進(jìn)行試驗(yàn)，以期獲得在某些方面性能優(yōu)良（如耐高溫、耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿等）的α-淀粉酶生產(chǎn)菌，從而為將來(lái)改良α-淀粉酶生產(chǎn)菌，以及滿足不同行業(yè)的需要奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：學(xué)校周邊、奶牛場(chǎng)及校內(nèi)食堂垃圾附近富含淀粉的土壤；十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：北京索萊寶科技公司，纖維系DE-52：英國(guó)Whatman公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（14.4～97.4 kDa）：大連TAKARA公司；葡聚糖凝膠G-50、葡聚糖凝膠G-150：上海維塔化學(xué)試劑有限公司；商品α-淀粉酶（枯草芽孢桿菌所產(chǎn)，純度93%）：北京酷來(lái)博科技公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：蘇州恒程化工科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG1850-WS高速臺(tái)式低溫離心機(jī)：盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY-E型電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-系列超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHWY-100B多振幅軌道搖床：鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；BWS-系列恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WFH-203紫外檢測(cè)儀：上海青浦滬西儀器廠；CXG-1電腦恒溫層析柜：上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

從學(xué)校周邊、奶牛場(chǎng)及校內(nèi)食堂垃圾附近的土壤中將采集的樣品裝入樣品袋中，并標(biāo)記時(shí)間和地點(diǎn)。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

平板分離培養(yǎng)基[13]：可溶性淀粉10.00 g、NaCl 5.04 g、瓊脂粉15.00g、蛋白胨10.00 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.00 g、KH2PO43.06 g、CaCl20.21g、（NH4）2SO42.50g、蛋白胨5.00g、蒸餾水1000mL，pH值自然，121℃滅菌20 min。

1.3.3 菌株的篩選

平板初篩：稱取10g采集樣品，放入錐形瓶中傾入100mL無(wú)菌水中，放入恒溫?fù)u床中37℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，用移液槍吸取1 mL并稀釋至10-6，從稀釋液中吸取20～50 μL涂平板，將涂好的平板在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后，挑選透明圈圈徑比較大的菌落并標(biāo)記備用[13-14]。

平板復(fù)篩：根據(jù)初篩平板上菌落的形狀大小、顏色及是否產(chǎn)淀粉酶的特性，將初篩后的各種菌種分別接種在復(fù)篩平板上，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24h。挑選透明圈較大的單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。

搖瓶復(fù)篩：平板復(fù)篩挑選出的單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，以120mL/250mL的裝液條件下，在恒溫?fù)u床內(nèi)37℃、120r/min培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液離心（8 000 r/min、10 min）后，取上清液測(cè)定酶活[15]。

1.3.4 菌種的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)平板培養(yǎng)和穿刺接種法培養(yǎng)篩選出的菌株，觀察其菌落形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，再挑取平板培養(yǎng)的單個(gè)菌落，通過(guò)革蘭氏染色將其分為革蘭氏陽(yáng)性菌G+和革蘭氏陰性菌G-；通過(guò)孔雀綠芽孢染色后，觀察該菌是否產(chǎn)生芽孢。

（2）菌株主要生理生化研究：篩選出劃線培養(yǎng)24 h后的菌種，然后挑取單菌落，進(jìn)行細(xì)菌的硝酸鹽還原試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)（過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)）、檸檬酸鹽試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)[16]。

（3）分子生物學(xué)鑒定：16S rDNA序列分析[17]：將提取的菌株總DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌專一性16SrDNA引物由TaKaRa公司合成，其正向引物（27f）：5′-AGTTTGATCCTGGTCAG-3′，反向引物（1492r）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；16S rDNA PCR反應(yīng)體系正向引物2 μL，反向引物2 μL，模板DNA4 μL，Primer star MAX 25 μL，ddH2O 17 μL。擴(kuò)增過(guò)程為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；55～65 ℃、30 s；72 ℃、2 min；共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳條件為：電壓110 V，電泳30～45 min。用上海生工的膠回收試劑盒進(jìn)行16S rDNA PCR產(chǎn)物純化。經(jīng)純化后，送與北京天一輝遠(yuǎn)公司完成測(cè)序。然后在NCBI中進(jìn)行BIAST同源性比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)初步鑒定菌株LZ-1。

（4）gyrB基因序列擴(kuò)增鑒定：湯際亮等[18]報(bào)道，單獨(dú)分析16S rDNA序列無(wú)法區(qū)分解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌這樣親緣關(guān)系很近的菌種。因此，采用gyrB序列分析法進(jìn)一步鑒定。gyrB基因通用引物序列：上游引物：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，下游引物：5′-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCN GT CAT-3′；其中Y、N、R表示兼并堿基，Y表示C或T，N表示A、T、C或G，R表示A或G。

PCR反應(yīng)條件：96℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收并送與北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序，然后在NCBI中進(jìn)行BLAST的序列同源性比對(duì)進(jìn)一步分析鑒定。

1.3.5 酶活力的測(cè)定

淀粉酶酶活力的測(cè)定[19]：采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定酶活力（以麥芽糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線），以商品α-淀粉酶作為對(duì)照，測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株在波長(zhǎng)520 nm處的光密度值，比較兩者的酶活力。酶活力單位定義：在40℃、pH=6.0條件下，每分鐘從1 mL 1%的可溶性淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.6 粗酶液的分離純化

硫酸銨沉淀法：發(fā)酵原液離心得上清液，緩慢加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末至30%飽和度，于冰箱（4℃）中放置過(guò)夜，10 000 r/min離心10 min，調(diào)節(jié)pH值，其主要的方法是加入氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后測(cè)定上清和沉淀中的淀粉酶活性和比活力。再在上清中緩慢加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末至65%飽和度，于冰箱（4℃）中放置過(guò)夜，離心機(jī)中10 000 r/min離心10min后去除上清收集沉淀，隨后用蒸餾水溶解沉淀，透析除鹽后粗酶液測(cè)定淀粉酶活力和比活力[20]。

凝膠過(guò)濾層析：用Sephadex G-50（柱床1.5 cm×20 cm）進(jìn)行脫鹽和Sephadex G-100（柱床1.5 cm×60 cm）分離蛋白質(zhì)，加蒸餾水處理葡萄糖凝膠，使其溶脹24 h，溶脹后經(jīng)反復(fù)沖洗，將上清中的細(xì)小顆粒棄掉，直到澄清[8]。進(jìn)行裝柱，用0.02 mol/L醋酸緩沖液（pH 7.0）平衡后上樣，上樣量為柱床體積的5%，然后進(jìn)行分離蛋白的監(jiān)測(cè)與收集，根據(jù)電腦上顯示的蛋白峰對(duì)應(yīng)的收集管測(cè)定Sephadex G-100純化液淀粉酶活力，將有酶活力的收集管集中在一起在聚乙二醇上進(jìn)行濃縮，使其體積為3 mL。

陰離子交換層析：用纖維素DE-52（柱床1.5 cm×80 cm）進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)，上樣量為3mL。在pH值為7.0的條件下，用0～1 mol/L的氯化鈉和0.02 mol/L醋酸緩沖液進(jìn)行線形梯度洗脫，自動(dòng)部分收集器（流速為1mL/min）收集洗脫液，每管3 mL，根據(jù)電腦上顯示的蛋白峰對(duì)應(yīng)的收集管測(cè)定Celluse DE-52純化液蛋白質(zhì)含量和酶活力，并計(jì)算酶的比活力[21-22]。

1.3.7 SDS-PAGE電泳及蛋白分子質(zhì)量測(cè)定

將酶活性峰區(qū)域的樣品進(jìn)行合并，適當(dāng)濃縮后通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)酶純度，并計(jì)算其分子質(zhì)量[9]。電泳中所采用的分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，電泳緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸緩沖液（pH值8.3）。加樣后，將電壓調(diào)至80V，大約1 h，等溴酚蘭標(biāo)示的樣品區(qū)域帶降到濃縮膠與分離膠相接觸的地方時(shí)，調(diào)整電壓為130 V，待溴酚蘭指示劑距邊緣0.5cm處電泳結(jié)束[10]。然后進(jìn)行染色和脫色，最后測(cè)算蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和淀粉酶遷移率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定淀粉酶分子質(zhì)量。

1.3.8 酶學(xué)性質(zhì)研究

溫度對(duì)淀粉酶的影響：取一定量的粗酶液，分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的溫度環(huán)境下測(cè)定酶活力[16]。

酶的熱穩(wěn)定性的研究：取一定量的粗酶液，在溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的環(huán)境下保溫30 min、60 min、120 min和180 min后，測(cè)定殘余酶活力。

pH值對(duì)淀粉酶的影響：取一定量的粗酶液，分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的環(huán)境下測(cè)定酶活力。

酶的pH值穩(wěn)定性的研究：取一定量的粗酶液，在pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的環(huán)境下放置30 min、60 min、120 min和180 min后測(cè)定殘留酶活力。

1.3.9 金屬離子、EDTA對(duì)酶活力的影響

在待測(cè)酶液中分別加入多種金屬離子（Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Zn2+）及EDTA至終濃度為2 mmol/L，45 ℃處理15 min，測(cè)定其酶活值在不同的金屬離子和EDTA的作用下，測(cè)定酶活力的大小[17]，每組設(shè)3個(gè)平行樣，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)淀粉酶產(chǎn)生菌采用碘熏法在平板上篩選出1種產(chǎn)淀粉酶的菌株，編號(hào)為L(zhǎng)Z-10，結(jié)果如圖1所示，測(cè)定其酶活力值為41.6 U/mL。

圖1 菌株LZ-10的透明圈Fig.1 Transparent circle of strain LZ-10

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果

通過(guò)平板培養(yǎng)后觀察菌株LZ-10為白色菌落，菌落不透明，有形狀似小傘的皺褶，由中央凸起向周?chē)鷶U(kuò)散，邊緣不整齊，挑起時(shí)較粘稠；芽孢可見(jiàn)，兩端鈍圓，直徑約0.5 μm，長(zhǎng)約2.0 μm。用孔雀綠芽孢染色后，能清晰看到芽孢，結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)菌株LZ-10進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1所示，菌株LZ-10與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的生理生化特性非常相近。

圖2 菌株LZ-10革蘭氏染色形態(tài)（A）及孔雀綠芽孢染色形態(tài)（B）（10×100）Fig.2 Morphology of strain LZ-10 after gram staining(A)and after malachite green spore staining(B)

表1 菌株LZ-10的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ-10

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株LZ-10的16S rDNA序列分析

圖3 菌株LZ-10的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of 16S rDNA sequence of strain LZ-10

圖4 菌株LZ-10的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain LZ-10

菌株LZ-10經(jīng)16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，將電泳后的條帶進(jìn)行膠回收后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將膠回收后經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送與北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，菌株LZ-10與特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等的16S rDNA都具有高度相似性，相似度都為99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖4）分析其都處于同一分支，所以通過(guò)16S rDNA不能確定該菌。

2.3.2 菌株的gyrB基因序列分析

菌株LZ-10經(jīng)gyrB基因序列擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳后的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并送與北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果：CAGTAGAATACGCTAGTA CTGTATCCTGTATGTGGTACGGGCTTTCTCAAGGTTG AAGTCTTCCCCAATACCTGTGCCGAGCGCTGTGATC ATAGAGCGAACTTCGTTGTTAGAAAGGATTTTATCC AGTCTGGCCTTTTCAACGTTTAGGATTTTACCTCTAA GCGGCAAAATGGCTTGGAAATGTCTGTCGCGTCCTT GTTTAGCAGATCCTCCGGCAGAGTCACCCTCTACGA TATATAACTCGGAGATGCTCGGATCTTTTGAAGAGC AGTCCGCTAACTTACCGGGCAGGTTTGAAATTTCCA AAGCACTCTTACGACGTGTTAGTTCACGGGCTTTTTT CGCAGCCATTCTTGCTCTTGCCGCCATTAAGCCTTTA TCGACAATTTTTTTGGCTGCATCTGGATTTTCCAGCA TAAATGTTTCCATCGCCGTAGAAAATAACGTATCGG TGATCGTCCGTGCTTCTGAGTTGCCCAGCTTTGTTTT CGTTTGGCCCTCAAACTGCGGATCAGGGTGTTTGATT GAAATAATCGCTGTCAGCCCTTCCCTTACGTCATCTC CGCTTAGGTTTGGATCATTTTCTTTAATAAGCCCTTT TTTTCTGGCGTAATCGTTGATAACACGAGTCATGCCC GTTCTGATGCCAGCTCCATGCGCACCGCCTTCGTATG TGT。在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析其與枯草芽孢桿菌具有99%的同源性，因此鑒定菌株LZ-10為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 淀粉酶的純化效果

將發(fā)酵原液用30%硫酸銨沉淀后，上清中酶活力為36.8 U/mL，在沉淀中未檢測(cè)出酶活力，故將沉淀?xiàng)壢?，將上清?5%的硫酸銨沉淀后用蒸餾水溶解，脫鹽后發(fā)酵液及各柱層析液中各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 脫鹽后發(fā)酵液及柱層析液中指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of the indexes of fermentation broth after desalination and liquid chromatography

2.5 SDS-PAGE電泳圖譜

對(duì)發(fā)酵原液、經(jīng)硫酸銨鹽析后的粗酶液、SephadexG-100純化后的酶液、DEAE-52離子交換層析后濃縮的酶液以及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE電泳（見(jiàn)圖5）。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值（Mr）為縱坐標(biāo)，遷移率（x）為橫坐標(biāo)，作出蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程lgMr=-1.2258x+2.3677，計(jì)算得到α-淀粉酶的分子質(zhì)量為55.4 kDa，表明獲得了純酶。

圖5 各酶液的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 Electrophoretogram of SDS-PAGE of each enzyme liquid

2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.6.1 酶的最適作用溫度與熱穩(wěn)定性

考察反應(yīng)溫度對(duì)酶活性與酶熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on enzyme activity

由圖6可知，酶活性隨著反應(yīng)溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，最適溫度為50℃。由圖7可知，在50℃環(huán)境中保溫180 min后，其酶活力仍在69%以上。在70℃環(huán)境中保溫180 min后，其酶活力仍在45%以上。在90℃條件下保溫30 min后，其酶活力急劇下降為30%左右，熱穩(wěn)定性較差；當(dāng)保溫超過(guò)120 min后，喪失酶活力。表明菌株LZ-10所產(chǎn)α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性較高。

圖7 處理溫度和時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.7 Effect of treatment temperature and time on enzyme activity

2.6.2 酶的最適pH值與pH穩(wěn)定性

考察不同pH值對(duì)酶活力與酶穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。

圖8 pH對(duì)酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

圖9 pH和處理時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.9 Effect of pH and treatment time on enzyme activity

由圖8可知，酶活性隨著pH值的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，菌株LZ-10的最適pH值為7，表明該酶為中性淀粉酶。由圖9可知，在pH值為7的環(huán)境下穩(wěn)定性較高，保溫180 min后仍具有90%的酶活力。在pH值為6時(shí)，保溫180 min后其酶活力下降到79%。在pH值為5環(huán)境下保溫30 min后仍具有80%以上的酶活力；保溫180min后其酶活力下降到65%。當(dāng)pH值為4、8時(shí)，保溫180 min后其酶活力下降到40%左右，其穩(wěn)定性較差。故酶的pH值穩(wěn)定范圍為5.0～7.0。

2.6.3 金屬離子、EDTA對(duì)酶活力的影響

在不同的金屬離子和EDTA的作用下，測(cè)定酶活力的大小，研究金屬離子對(duì)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，Ca2+、Mg2+、Na+、K+對(duì)該酶有激活作用，EDTA、Fe2+、Zn2+對(duì)酶有抑制作用。

圖10 金屬離子和EDTA對(duì)酶活力的影響Fig.10 Effect of metal ion and EDTA on enzyme activity

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選到的一株產(chǎn)淀粉酶菌株LZ-10，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性檢測(cè)，16S rDNA分子鑒定以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，由于特基拉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌與菌株LZ-10同源性很高，為進(jìn)一步鑒定該菌株，選擇gyrB基因序列擴(kuò)增后測(cè)序進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。純化后的淀粉酶比活力為59.91 U/mg，純化倍數(shù)為4.53，回收率為60.5%；α-淀粉酶分子質(zhì)量為55.4 kDa。本實(shí)驗(yàn)篩選的菌株LZ-10產(chǎn)生的淀粉酶，經(jīng)驗(yàn)證最適作用溫度為50℃，在50～70℃條件下穩(wěn)定性較高；最適pH值為7.0，在pH 5.0～7.0的條件下穩(wěn)定性較高。2 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Na+、K+對(duì)淀粉酶有激活作用；EDTA、Fe2+、Zn2+對(duì)淀粉酶有抑制作用。

[1]陳相達(dá)，戴慧慧，劉 燕，等.一株高產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，12（1）：40-43.

[2]高永生，朱麗云，朱貴州，等.枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶規(guī)律及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11964-11965.

[3]王傳旭，于慧瑛，曹建斌，等.1株產(chǎn)淀粉酶嗜鹽細(xì)菌X50的分類鑒定及其粗酶活特性研究[J].微生物學(xué)雜志，2017，37（1）：78-79.

[4]閆祥洲，劉金愛(ài)，吳 勃，等.一種低溫α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].飼料工業(yè)，2014，35（6）：15-16.

[5]劉雅琴，陳海魁，孔令全.α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選與誘變選育[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（9）：1-2.

[6]閆永飛，石亞偉.莜麥中病程相關(guān)蛋白的分離純化及其幾丁質(zhì)酶活性分析[J].食品工業(yè)科技，2012，33（1）：94-95.

[7]胡元森，潘 濤，李翠香.酸性α-淀粉酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（3）：199-200.

[8]譚海剛，李 靜.生淀粉酶細(xì)菌菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].糧油食品科技，2012（5）：56-57.

[9]劉金嵐，付 剛，董會(huì)娜，等.通過(guò)信號(hào)肽篩選優(yōu)化耐高溫α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的分泌[J].工業(yè)微生物，2017，47（1）：17-18.

[10]楊韻霏，李由然，張 梁，等.細(xì)菌麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的誘導(dǎo)型異源表達(dá)[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017（2）：263-264.

[11]張洪志，徐慶陽(yáng)，曹華杰，等.α-淀粉酶抑制劑生物合成途徑和代謝流分析（英文）[J].食品科學(xué)，2017，38（4）：118-119.

[12]曾靜，郭建軍，袁 林.定點(diǎn)突變提高極端嗜熱α-淀粉酶ApkA的高溫活性和熱穩(wěn)定性[J].食品科學(xué)，2017，38（2）：20-21.

[13]黃玉柳.草魚(yú)腸道細(xì)菌產(chǎn)消化酶能力的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：330-331.

[14]尚喜雨，柯 濤，王玲玲，等.產(chǎn)脂肪酶酵母的篩選及菌種鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，39（20）：10512-10513.

[15]劉雅琴，陳海魁，李瑞雪.α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2010.39（34）：19263-19264.

[16]周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].3版.北京：高等教育出版社，2013：30-180.

[17]王曉燕，高潤(rùn)池，廖昌瓏，等.Geobacillussp.A27的分離篩選及其淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2011，32（1）：151-153.

[18]湯際亮，張煜坤，孫得發(fā)，等.獺兔盲腸中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013，35（19）：149-151.

[19]賈瑞博，胡榮康，周文斌，等.米曲霉（Aspergillus oryzaeFAFU）淀粉酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（11）：71-75.

[20]劉雅琴，陳海魁，李瑞雪.α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，39（34）：19263-19265.

[21]楊歌德，姜玉梅，周宏博.凝膠過(guò)濾層析分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中三種過(guò)濾介質(zhì)分離效果的比較[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，36（3）：242-243.

[22]王紹輝.耐熱酸性α-淀粉酶的基因克隆和分離純化[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2010.