付國斌 曹敏

2017

年11月27日，世界上首個體細胞克隆猴“中中”在中國科學院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心的非人靈長類平臺誕生；12月5日，第二個克隆猴“華華”誕生。該項成果于2018年1月25日作為封面文章在線發(fā)表在生物學頂尖學術期刊《細胞》上。這標志中國率先開啟了以體細胞克隆猴作為實驗動物模型的新時代，實現了中國在非人靈長類研究領域由國際“并跑”到“領跑”的轉變。

含義日漸豐富的克隆

克隆是指創(chuàng)造出一個與原來生物體擁有一模一樣遺傳信息的生物體。它原本是指基因的復制，而現在用處廣泛，早已超出這個含義。此概念的內涵和外延即便是在生物學界也不盡相同，克隆在分子生物學上主要是指DNA的復制，在細胞學上指培養(yǎng)一群同基因組的細胞，在動物學上指獲得同基因組的生物個體。

雖然高等動物普遍采用有性生殖，但克隆是否在高等生物中自然存在呢？答案是肯定的，例如同卵雙胞胎，源自同一個受精卵的分裂，具有同樣的基因組。這也是人工克隆動物的一個思路，將早期胚胎分為多個小的胚胎，然后再分別發(fā)育成多個個體。這種方式建立在早期胚胎細胞的可塑性（Plasticity）上，此時細胞的命運依然可逆并具有全能性。而后期細胞，特別是已成熟的細胞并不具有這種特性。采用這種方式不僅在技術上困難，更為重要的是因為必須用早期胚胎，所以極大地限制了克隆技術的使用范圍。

很多特性必須要等到個體成熟后才能獲知，而如果此時再想克隆個體就需要換種思路：采用體細胞核移植（Somatic cell nuclear transfer， 簡稱SCNT）技術。由于動物個體的很多特征由基因控制，因此只要將基因組所在的細胞核移植到去核的卵母細胞或早期胚胎細胞中，再進一步發(fā)育，即可獲得和被移植個體同特征的個體。狹義上的動物克隆就是指使用體細胞核移植技術的克隆，目前大多數動物克隆都采用這種方式。

動物克隆的簡單歷程

得益于20世紀上半葉發(fā)育學等學科的發(fā)展，1952年，美國科學家羅伯特·布里格斯（Robert Briggs）和托馬斯·金（Thomas King）將青蛙受精卵的細胞核移植到卵細胞中并發(fā)育出胚胎。這是人類第一次用細胞核移植技術成功發(fā)育出胚胎，這次實驗成功地進行了104次核移植，培育出35個胚胎，其中27個成長為蝌蚪。這種發(fā)育成功率在普通人看來可能很低，但在克隆界算是很高了，簡直是高出了天際。

當然，這與實驗采用的動物及細胞有關。首先，青蛙體外排卵，卵細胞體積大，非常便于實驗操作。其次，細胞核來源于受精卵，本身具有發(fā)育成胚胎并長成個體的能力。最后，青蛙受精卵在水中能成長發(fā)育，要求比較低。雖然實驗看起來采取了特殊的模式，但依然意義非凡。因為即便今日人類依然不清楚細胞核的取出和移植對細胞有怎樣的影響，但這次實驗成功了，從結果上肯定了技術的可行性，為動物克隆開創(chuàng)了一片天地。

雖然青蛙克隆實驗成功了，但人們的好奇心并不會因此而減弱，相反會變得更強，其中最重要的兩個疑問是：成熟的體細胞核能否移植并發(fā)育，其他動物能否被克隆。

1958年，第一個問題便有了答案。英國牛津大學的科學家約翰·戈登（John Gurdon）成功地將蝌蚪腸上皮細胞的細胞核移植到青蛙卵細胞里，并發(fā)育出胚胎。在肯定了第一個問題后，第二個問題的答案也沒有讓人們等太久。1963年，中國科學家童第周在世界上第一次成功克隆了亞洲鯉魚，這次克隆是將一條雄性鯉魚的細胞核移植到雌性鯉魚的卵母細胞中。此外，1973年童第周還將亞洲鯉魚的基因移植到歐洲鯽魚中，第一次實現了種間克隆。

高等動物羊、鼠和牛的克隆，分別發(fā)生在1984年、1986年和1994年，但由于它們都使用胚胎分裂技術，而非使用成熟的體細胞，影響力較小，沒有受到很大關注。但很快克隆技術便受到了前所未有的關注，讓這個專業(yè)詞匯從生物學走進了普通公眾，甚至走進了科幻電影里。這就是1996年英國科學家基思·坎貝爾（Keith Campbell）和伊恩·威爾穆特（Ian Wilmut）用成熟體細胞成功克隆了一只羊，它的名字叫“多莉”（Dolly）。

多莉一出生便名揚世界，它應該是迄今為止世界上最有名的動物，即便死后知名度依然不減。在經歷277次核移植，產生29個胚胎，放入13個代孕母羊后，最后有且只有多莉幸運地出生了。多莉有3個母親，分別為它提供細胞質、細胞核和子宮。多莉只活了6年多，于2003年去世，共有3次生育，產生6個后代。

科研成果能夠在第一時間引起大眾關注的并不多，引起大眾關注并且有真正重大突破的可能還要再少一個數量級，而多莉絕對算是其中最亮眼的科學事件之一。它不僅第一時間登上了各大新聞版面，還給克隆界注入了迄今為止最為強勁的強心劑。多莉的誕生證明了克隆高等動物的可行性，并且可以正常生活和生育。從此之后，多種高等動物如雨后春筍般被克隆成功。

目前，已被克隆的高等物種有20多種，其中克隆牛和鼠誕生于1997年，和人類相近的獼猴在1999年被科學家利用胚胎分離的方式克隆成功，克隆豬出現于2000年，克隆兔、騾子、鹿和馬則在2003年成功，克隆狗、果蠅在2005年誕生，克隆駱駝于2009年在迪拜誕生。

近幾年來，隨著科學的發(fā)展，克隆的應用更加廣泛并開始走向商業(yè)。2009年，一種已滅絕的庇里牛斯山羊（Pyrenean ibex）被克隆成功，這是人類第一次將已滅絕的物種克隆出來。雖然它僅活了7分鐘，但為滅絕動物的再生打開了一扇亮窗。

克隆猴子的誕生

在成功克隆猴之前，中科院研究人員嘗試了不同的方法，均告失敗，但只有一種方法最終奏效。在克隆猴子的過程中，有四個關鍵性的節(jié)點：胚胎構建、卵細胞激活、核基因啟動、著床后發(fā)育。如何攻克這四個節(jié)點對于研究人員來說也是極大的挑戰(zhàn)。研究顯示，已分化的猴細胞核對體細胞核移植技術有抗性，因此在細胞核轉移后，引入表觀遺傳調節(jié)劑，打開或關閉抑制胚胎發(fā)育的基因。

在這項研究中，研究人員設計了兩組實驗：一組是利用胎兒纖維組織母細胞，作為融合細胞的細胞核來源，這些細胞來自流產幼猴的組織；另一組實驗，利用成年猴子的卵丘細胞作為融合細胞的細胞核來源。

兩組實驗取得了不同的結果：在第一組實驗中，21只代孕母猴中的6只成功懷孕，最終生下了2只健康的猴子，它們就是“中中”和“華華”；另一組研究，42只代孕母猴中有22只成功懷孕，最后也有兩只猴子出生，可惜的是，它們短暫存活后死亡。

上文提到在1999年已有獼猴被克隆成功，只不過它的誕生是通過胚胎分裂的方法，即胚胎發(fā)育到8細胞時，人為地被分為2個4細胞的胚胎，再分別發(fā)育。該方法并非使用常規(guī)的動物克隆技術——體細胞核移植進行，因此，無論從科學意義還是實用性上，都比較受限。

而此次中科院神經所的工作系通過體細胞核移植技術克隆猴子，難度更大。為建立體細胞核移植技術的流程，快速而精準地從卵細胞中取出細胞核，并促使體細胞與去核的卵母細胞融合，該項研究論文的第一作者劉真博士花了3年時間練習以及優(yōu)化該流程。最終在表觀遺傳因子的刺激下，重新激活被抑制的基因，大大提高了胚胎發(fā)育的效率和代孕母猴成功懷孕的比例。

克隆猴問世的意義

體細胞克隆猴的成功將推動中國率先發(fā)展出基于非人靈長類疾病動物模型的全新醫(yī)藥研發(fā)產業(yè)鏈，促進針對阿爾茨海默病、自閉癥等腦疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進程，同時也讓中國成為世界腦科學人才的匯聚高地。

理想的動物模型是人類探究疾病、進行基礎醫(yī)學試驗的重要工具。一直以來，科學家孜孜不倦地追求理想的動物模型，尤其是對靈長類動物模型的構建。有關靈長類的很多研究問題，都可以通過這一技術構建的靈長類動物模型得到解答。長遠來看，靈長類動物做疾病模型優(yōu)勢巨大。目前很多疾病的分析方法還沒有完全在靈長類模型上成熟應用，不過這也是時間和經費的問題。研究靈長類和研究人類有很多相似性，由于能收割猴的組織直接分析，從而會協(xié)助和建立無創(chuàng)或微創(chuàng)方法用于臨床，意義重大。

克隆人距離我們到底還有多遠

自從克隆羊多莉誕生之后，最近20年克隆技術的發(fā)展越來越快，多種動物相繼被克隆成功。而人類同它們并沒有本質區(qū)別。此時，大眾關心的另一個核心問題就是：克隆人距離我們到底還有多遠。

克隆技術說起來并不復雜，將細胞核轉入到卵母或胚胎細胞質中，然后即可像受精卵一樣發(fā)育。然而即便已探索了一個多世紀，這其中的基本問題依然很多，例如去核過程對細胞有什么影響、被移植的細胞核在進入胚胎細胞質之后發(fā)生了什么、克隆的成功率和這些操作有沒有關系、如何讓受精卵在體外更好地發(fā)育等。這些問題的解決，還需要廣大科研人員的努力，而且目前看起來并不會輕松。

人類距離克隆人，也許只有一個玻璃窗的距離，但社會輿論、倫理道德和法律禁止任何人向前踏出這一步。非人靈長類動物克隆研究可接受的操作是什么？不可接受的操作是什么？面對此類問題，我們清晰地意識到，未來在非人靈長類動物的研究中，科學家還應嚴格地遵循倫理準則。

（作者單位為山東大學附屬省立醫(yī)院）