翟昌林，錢 鋼，胡惠林，唐關(guān)敏

(嘉興市第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 嘉興 314000)

心肌缺血后血流恢復(fù)對缺血區(qū)的供應(yīng)稱為缺血再灌注，但在再灌注過程中同樣會造成心肌細(xì)胞的凋亡，這一過程稱為I/R，即缺血再灌注損傷(I/R)[1]。缺血再灌注損傷通常發(fā)生在一些臨床上對急性冠脈綜合征的一些干預(yù)過程中，例如溶栓，支架介入或者心臟移植手術(shù)。相關(guān)研究顯示AKT通路調(diào)節(jié)了哺乳動物細(xì)胞的大部分應(yīng)答，在I/R過程中AKT通路的激活可抑制細(xì)胞的凋亡并激活存活路徑[2]。依布硒啉是一種具有很好的過氧化物酶作用的有機(jī)硒化合物，研究報道依布硒啉可通過抗氧化作用，抑制氧自由基的生成積累，減少脂質(zhì)過氧化作用來抑制心肌細(xì)胞凋亡[3]。然而在I/R過程中依布硒啉是否通過AKT/eNOS通路發(fā)揮再灌注缺血損傷保護(hù)作用及其具體機(jī)制仍未知，本文以此為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鼠齡8周雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～260g，充足食水，在21±2℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；TUNEL檢測試劑盒、NO檢測試劑盒購自Roche，TNF-α、Caspase-3、磷酸化AKT/eNOS的兔多克隆抗體均購自Abcam，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自Roche，依布硒啉購自美國cayman生物公司。

1.2 大鼠心肌再灌注模型建立 參照Zeng XC等[4]文獻(xiàn)中方法：3%的戊巴比妥鈉以30mg/kg進(jìn)行腹腔注射，麻醉后固定于手術(shù)臺面，行氣管切開，接呼吸機(jī)維持呼吸，右頸動脈插管進(jìn)入左心室采集心功能相關(guān)參數(shù)，于胸骨左緣心尖搏動最強(qiáng)處行縱形切口，鈍性分離皮下組織，剪開心包暴露心臟，以左冠狀靜脈為參照，于肺動脈圓錐右側(cè)，鑷子提撥起左心耳，左心耳下緣1.5mm處用線穿過，連同硅膠管一起結(jié)扎，結(jié)扎冠狀動脈至無血流通過1h，松開冠狀動脈結(jié)扎，再持續(xù)灌注2h，即完成心肌缺血再灌注損傷模型的建立。結(jié)扎后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段呈弓背向上抬高大于0.1mv，QRS波變寬振幅擴(kuò)大，心肌顏色變灰白為阻斷成功標(biāo)志，造模成功后即刻采集心功能各項(xiàng)參數(shù)后再通過頸動脈采血提取血液樣本1mL，術(shù)后即刻頸椎脫臼法處死各組大鼠并摘除心臟，術(shù)中死亡大鼠不記入實(shí)驗(yàn)。

1.3 動物分組 30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。假手術(shù)組：手術(shù)過程中穿線但不予結(jié)扎，術(shù)前1 min腹腔推注生理鹽水2mL；缺血再灌注組：結(jié)扎1 h，再灌注2 h，術(shù)前10 min腹腔注射生理鹽水2 mL；依布硒碄組：結(jié)扎1 min，再灌注2 h，術(shù)前10 min以5mg/kg的劑量腹腔推注依布硒啉。

1.4 心功能的測定 造模成功后即刻通過壓力-體積導(dǎo)管(1.9 F；Scisense儀器，安大略，加拿大)記錄并計算左室收縮末期壓力(LVESP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)，和每搏功(SW)，收縮末期壓力-容積關(guān)系(ESPVR)和舒張末期壓力-容積關(guān)系(EDPVR)。

1.5 TUNEL監(jiān)測心肌細(xì)胞凋亡情況 再灌注結(jié)束后，摘除各組大鼠心臟，石蠟包埋切片，將標(biāo)本用二甲苯透明，乙醇脫水后PBS漂洗2次，Proteinase K工作液去除組織蛋白；各組組織分別加對應(yīng)的50μL TUNEL檢測液，待玻片干后，加50μL TUNEL反應(yīng)混合液，37℃暗濕盒中孵育60 min，PBS漂洗3次；于熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞；待干后加50μL converter-POD，暗濕盒中37℃反應(yīng)30min。PBS漂洗3次；在組織處加50～100μL DAB底物，反應(yīng)15～25℃×10min；PBS漂洗3次；拍照后再用蘇木素復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行計數(shù)(100～200個細(xì)胞)并拍照。

1.6 各組心肌Akt/eNOS磷酸化情況及TNF-α、Caspase-3蛋白表達(dá) 再灌注后摘除每組大鼠心臟，于冰上對心肌組織裂解取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，提取100 μg的心肌組織蛋白于12% SDS-PAGE凝膠上，電泳分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶封閉后在膜中加入目標(biāo)蛋白(Akt、p-Akt、NOS、eNOS、TNF-α、Caspase-3)相對應(yīng)的稀釋后的一抗，常溫孵育2 h，TBST洗脫3次后加1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗封閉，孵育60min，ECL化學(xué)顯色發(fā)光。通過Quantity one圖像分析軟件對各組條帶亮度值進(jìn)行分析計算。

1.7 NO測定 再灌注后，立刻通過頸動脈采取各組每只大鼠血液樣本1mL，4℃離心機(jī)中離心后取上清液，按照試劑盒方法檢測各組樣本中NO的含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用F分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能情況 與假手術(shù)組和依布硒啉組相比，心肌缺血再灌注組LVEDP升高，LVESP、SW、ESPVR和EDPVR均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心臟功能參數(shù)比較

LVESP：左室收縮末期壓力，LVEDP：左室舒張末期壓力，DP：上升的壓力，SW：每搏功；ESPVR：收縮末期壓力-容積關(guān)系，EDPVR：舒張末期壓力-容積關(guān)系；

注：*與假手術(shù)組比較，P<0.05；#與缺血再灌注組比較，P<0.05。下同。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡情況 通過TUNEL染色，正常大鼠心肌細(xì)胞的TUNEL染色呈藍(lán)色，而壞死或凋亡的陽性心肌細(xì)胞細(xì)胞核染色呈棕色，見圖1。利用圖像分析軟件對圖1等各組圖像進(jìn)行分析并計算AI，結(jié)果顯示：缺血再灌注組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為29.8%±6.8%，依布硒啉組的凋亡指數(shù)為19.8%±1.9%，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 TUNEL法檢測各組心肌細(xì)胞凋亡圖(400×)

2.3 各組心肌TNF-α、Caspase-3蛋白表達(dá)的情況 通過Quantity one檢測軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析，根據(jù)圖2條帶，缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，心肌組織caspase3和TNF-α的表達(dá)分別升高了4.6倍和4.9倍；依布硒啉組比缺血再灌注組則減少了caspase-3 和 TNF-α的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 western bolt檢測各組心肌Caspase-3、TNFα的表達(dá)情況

2.4 Akt/eNOS信號通路磷酸化及NO表達(dá)的情況 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大鼠心肌細(xì)胞AKT和eNOS的磷酸化水平及NO的水平均出現(xiàn)了下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)；而依布硒啉組大鼠心肌組織Akt和eNOS的磷酸化水平、NO水平均回升，依布硒啉與假手術(shù)組相比，血NO的含量也顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而p-Akt與p-eNOS的相對表達(dá)量比較則均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 western bolt檢測各組心肌細(xì)胞Akt/eNOS通路磷酸化的情況

3 討論

心肌I/R是目前臨床上常見的并發(fā)癥，不僅造成心肌細(xì)胞凋亡，破壞心肌組織正常結(jié)構(gòu)，更會造成心功能的下降或者致死性的心律失常[5]。在I/R過程中心肌細(xì)胞的凋亡存在著兩個主要的信號通路，一個是通過線粒體激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑，另一個是通過Fas配體或TNF-α的外在路徑[6]。因此，如何通過藥物靶向地阻斷凋亡路徑也為我們的科學(xué)研究提供了新思路。在我們的實(shí)驗(yàn)中，缺血再灌注組的TNF-α、Caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)，驗(yàn)證了心肌缺血再灌注損傷與凋亡路徑的激活密不可分，依布硒啉在I/R過程中抑制了心肌凋亡相關(guān)途徑中TNF-α 和 caspase-3蛋白的表達(dá)，這說明依布硒啉具有抑制凋亡路徑的作用。

依布硒啉是一種脂溶性化合物，因此很容易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，從而發(fā)揮顯著的抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)依布硒啉在多種器官的缺血再灌注過程中都發(fā)揮了保護(hù)作用。Chen Y等[7]研究發(fā)現(xiàn)依布硒啉通過減少氧化應(yīng)激來減輕I/R損傷；Steinbrenner H等[8]報道在一例心臟外科手術(shù)中，依布硒啉抑制自由基的形成發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用；Lindenblatt N等[9]動物實(shí)驗(yàn)研究顯示依布硒抑制血細(xì)胞聚集體的形成及保護(hù)血管內(nèi)皮功能障礙從而發(fā)揮保護(hù)心肌I/R的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)依布硒啉可以減輕大鼠心肌細(xì)胞的缺血再灌注時心功能的損害；同時依布硒啉減輕了大鼠心肌細(xì)胞的再灌注凋亡。

Akt通路在心肌I/R中得作用一直是研究的熱點(diǎn)，Yuan Q等[10]研究發(fā)現(xiàn)：通過PI3K/Akt抑制劑來抑制AKT的信號后心肌缺血再灌注的保護(hù)作用缺失了。AKT的磷酸化促進(jìn)了許多靶蛋白的激活，其中包括eNOS。Fang R等[11]的研究表明：體內(nèi)或體外應(yīng)激時AKT磷酸化也介導(dǎo)了eNOS的快速應(yīng)答。激活的eNOS在I/R過程中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[12]。我們的實(shí)驗(yàn)則以Akt/eNOS通路為出發(fā)點(diǎn)展開驗(yàn)證依布硒啉發(fā)揮I/R損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明：在I/R過程中依布硒啉導(dǎo)致了Akt的磷酸化也促進(jìn)了其下游蛋白eNOS的磷酸化，eNOS表達(dá)的同時也促進(jìn)了血液中血管內(nèi)皮舒張因子NO濃度的提高，NO能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和凋亡以及遷移，是血管生成的必須因子[13]，因而可以起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

綜上所述，依布硒啉可以通過激活A(yù)kt/eNOS通路從而發(fā)揮保護(hù)心肌I/R作用，有關(guān)于依布硒啉通過各種信號通路相互作用從而發(fā)揮保護(hù)心肌I/R作用的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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