董 帥 鄭紅俊 鐘 時(shí)

(廣州市香雪制藥股份有限公司,廣州 510530)

主要組織相容性復(fù)合物(Major histocom-patibility complex，MHC)能將抗原短肽遞呈到細(xì)胞表面并被位于T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)識(shí)別，這種識(shí)別對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的病原體和癌癥控制以及刺激和保持有效的細(xì)胞毒性應(yīng)答起著至關(guān)重要的作用，在自身免疫疾病的發(fā)展中也可能發(fā)揮重要功能。抗原肽結(jié)合的MHC分子(peptide MHC，pMHC)與TCR之間相互作用機(jī)制的探究對(duì)于理解疾病的發(fā)展和建立新的治療策略具有重要意義[1]。但早期研究發(fā)現(xiàn)，單體的pMHC復(fù)合物與TCR的相互作用較弱，解離速率快，不能形成穩(wěn)定的相互作用[2]，因此不能用于T細(xì)胞檢測(cè)。1996年，Altman等[3]首次報(bào)道了pMHC的四聚化為pMHC與TCR的相互作用提供了足夠的穩(wěn)定性并用于抗原特異性T細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)和分析。隨著癌癥免疫治療的發(fā)展，越來越依賴于低親和的pMHC/TCR相互作用的檢測(cè)，對(duì)pMHC的多聚體又提出了新的要求。本文綜述了目前已報(bào)道的主要pMHC多聚體技術(shù)在抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)和分離方面的研究進(jìn)展。

1 pMHC單體的結(jié)構(gòu)

MHC 主要包含Ⅰ類和Ⅱ類，均為異源二聚體，分別由一個(gè)結(jié)合多肽的N端胞外區(qū)、一個(gè)含有Ig結(jié)構(gòu)域的胞外區(qū)、一個(gè)疏水性的跨膜區(qū)和一個(gè)C端胞內(nèi)區(qū)組成。MHC Ⅰ類分子包含一條α重鏈和β2m蛋白，α重鏈由3個(gè)胞外球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，位于N端的結(jié)構(gòu)域α1和α2共價(jià)結(jié)合構(gòu)成抗原肽的結(jié)合位點(diǎn)，而Ig樣的α3結(jié)構(gòu)域與β2m蛋白結(jié)合(圖1A)。MHC Ⅱ類分子包含一條α鏈和一條β鏈，α鏈和β鏈的α1和β1結(jié)構(gòu)域組成了多肽的結(jié)合區(qū)，α2和β2結(jié)構(gòu)域形成與Ig折疊同源的球形環(huán)，與多肽的結(jié)合無關(guān)[4](圖1B)。

圖1 MHC分子結(jié)構(gòu)圖示Fig.1 Structure of MHC

2 pMHC多聚體的結(jié)構(gòu)

pMHC多聚體技術(shù)以可溶的pMHC為基礎(chǔ)，在重組表達(dá)時(shí)截除MHC分子的跨膜區(qū)及C末端胞內(nèi)區(qū)。pMHC多聚體技術(shù)的發(fā)展主要集中于多聚體中pMHC價(jià)數(shù)的增加，以增強(qiáng)多聚體與T細(xì)胞的相互作用親合力，以及連接到多聚體復(fù)合物上的熒光分子數(shù)量的增加以增強(qiáng)染色強(qiáng)度，提高它們的檢測(cè)性能[5]。除了熒光分子標(biāo)記的pMHC多聚體外，還有其他分子標(biāo)記的pMHC多聚體以適應(yīng)不同的應(yīng)用[6,7]。

2.1pMHC二聚體(Dimers) pMHC二聚體利用了免疫球蛋白IgG作為二聚支架(圖2A)。二聚的pMHC:IgG結(jié)構(gòu)補(bǔ)償了單體的pMHC-TCR相互作用相對(duì)較低的親和力特性，提供了更強(qiáng)的結(jié)合親合力。MHC:IgG 二聚的融合蛋白在1993年被構(gòu)建出來，MHC分子的重鏈通過重組DNA技術(shù)被融合到鼠免疫球蛋白IgG1重鏈可變區(qū)的N末端。包含融合蛋白基因的表達(dá)載體隨后與人類-b2-微球蛋白(β2m)基因共同轉(zhuǎn)化免疫球蛋白重鏈缺陷的骨髓瘤細(xì)胞株，經(jīng)表達(dá)純化后的MHC能夠方便地被標(biāo)記和負(fù)載目標(biāo)短肽[8]。此外，pMHC二聚體中免疫球蛋白支架的鉸鏈區(qū)為pMHC結(jié)合到T細(xì)胞上提供了較多的靈活性[9]。

2.2pMHC四聚體(Tetramers) pMHC的四聚體首次被Altman 等于1996年報(bào)道用于抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的直接觀察和計(jì)數(shù)[3]。pMHC的四聚化是基于鏈霉親和素蛋白(Streptavidin，SA)的四聚特性以及SA與生物素的高親和力結(jié)合特性。在構(gòu)建四聚體時(shí)，首先在MHC分子重鏈的C-末端添加一個(gè)15個(gè)氨基酸的生物素連接酶BirA依賴的基底肽(BirA substrate peptide,BSP)，再與β2m和特異的抗原短肽折疊復(fù)性，經(jīng)純化后使用BirA進(jìn)行體外生物素化。生物素化的pMHC與熒光標(biāo)記的SA混合，形成pMHC的四聚體[3](圖2B)。由于pMHC四聚體具有四面體的空間結(jié)構(gòu)，在與T細(xì)胞表面的TCR相互作用時(shí)，一次最多能結(jié)合3個(gè)TCR[9]。

2.3pMHC五聚體(Pentamers) pMHC的五聚體包含五個(gè)pMHC分子，并通過自組裝的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(Coild coil domain)五聚化(圖2C)。五聚體中5個(gè)pMHC復(fù)合物朝向相同，提供了更高的親合力，并且每個(gè)pMHC五聚體能夠偶聯(lián)多至5個(gè)的熒光分子或生物素標(biāo)簽用于明亮有效的標(biāo)記[10]。

2.4Dextramers Dextramers是基于葡萄聚糖(Dextran)骨架的pMHC多聚體(圖2D)。Dextrans是葡萄糖主要通過1～6連接和1～3支鏈連接的多聚物，其長(zhǎng)度可變，分子大小從十幾到幾百kD。通過將熒光分子和鏈霉親和素蛋白共價(jià)連接到Dextrans上，再與生物素化的pMHC混合制備Dextramers。Dextramers是pMHC不均一的多聚體。一個(gè)270 kD的Dextran平均能夠交連20個(gè)熒光素和10.5個(gè)鏈霉親和素蛋白，最多能聚合42個(gè)pMHC單體，如此高價(jià)的pMHC多聚體具有更高的TCR結(jié)合親合力，同時(shí)結(jié)合的熒光分子數(shù)量更多，使得抗原特異性T細(xì)胞染色強(qiáng)度更高[11]。此外，也可通過另一種方式制備Dxtramer，即先將生物素化的pMHC單體與熒光標(biāo)記的SA以3∶1的比例混合，再利用未完全飽和的SA生物素結(jié)合位點(diǎn)與生物素化的Dextran混合制備多聚體[12]。

2.5pMHC八聚體(Octamers) pMHC的八聚體也是以鏈霉親和素蛋白作為支架(圖2E)。通過在MHC分子重鏈的C-末端引入一個(gè)游離的半胱氨酸殘基，以便使用烷基化試劑進(jìn)行生物素標(biāo)記。在pMHC生物素化時(shí)，使用含有分支的包含生物素和兩個(gè)馬來酰胺部分的肽(DMGS-生物素)進(jìn)行生物素化，獲得的pMHC二聚體再與熒光標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白混合形成八聚化的pMHC。當(dāng)使用不含分支的生物素連接的烷基化試劑時(shí)，可以制備四聚的pMHC，區(qū)別于使用生物素連接酶BirA進(jìn)行生物素化制備的四聚體。使用烷基化試劑進(jìn)行生物素化制備的pMHC多聚體更易獲得均一的組份[13]。

2.6pMHC十二聚體(Dodecamers) pMHC十二聚體的核心支架是一個(gè)經(jīng)過位點(diǎn)突變無生物素結(jié)合活性的鏈霉親和素蛋白[14]。通過在核心支架SA末端引入游離半胱氨酸并使用烷基化試劑進(jìn)行生物素化后，與熒光標(biāo)記的正常的具有生物素結(jié)合活性的SA以1∶4反應(yīng)，形成SA的五聚體，制備的SA的五聚體再與生物素化的pMHC混合， 完成pMHC的十二聚化[15](圖2F)。

圖2 pMHC多聚體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structure of pMHC multimersNote:A.The dimer complex;B.The tetramer complex;C.The pentamer complex;D.The dextramer complex;E.The octamer complex;F.The dodecamer complex.

圖3 Streptamer和Histamer復(fù)合體可逆染色技術(shù)的基本原理Fig.3 Streptamer and Histamer complex and basic princi-ple of reversible staining technologyNote:A.The streptamer complex and the basic principle of the reversible staining technology;B.The Histamer complex and the basic principle of the reversible staining technology.

2.7Streptamers Streptamer是一種能可逆聚化的pMHC多聚體(圖3A)。由Neudorfer等[16]設(shè)計(jì)用于抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)的檢測(cè)和純化。Streptamers由兩部分組成，一是C-末端融合表達(dá)了Strep-tagIII標(biāo)簽的pMHC，另一個(gè)是Strep-Tactin聚合物。Strep-tagIII由兩個(gè)Strep-tagII串聯(lián)而成，Strep-tagII包含八個(gè)氨基酸殘基(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)，與工程改造過的鏈霉親和素蛋白衍生物Strep-Tactin具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力(KD～10-6M)。pMHC-Strep-tagIII與熒光標(biāo)記的Strep-Tactin聚合形成的多聚體，可被生物素的加入競(jìng)爭(zhēng)性的解聚，通過一輪的清洗，pMHC-Strep-tagIII能自發(fā)地從CTL上分離。Streptamer的可逆聚化性質(zhì)，在臨床應(yīng)用中，可使抗原特異的CTL被轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)而不帶任何的Streptamers殘基[9]。

2.8Histamers Tischer等報(bào)道了另一種能可逆聚化的pMHC多聚體，被命名為Histamer(圖3B)。Histamer利用了6×組氨酸標(biāo)簽與金屬鈷的親合特性，pMHC的多聚化是將帶6×組氨酸標(biāo)簽的pMHC與表面含有鈷離子的磁珠混合，形成的多聚體可通過加入L-組氨酸解聚。L-組氨酸能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合磁珠表面的鈷離子。由于使用了磁珠制備多聚體，在抗原特異性T細(xì)胞分離時(shí)，可直接使用磁性吸附進(jìn)行分離。這種方法可參照GMP(good manufactur-ing practice)被應(yīng)用于分離高純度的抗原特異的T細(xì)胞亞群，而后被直接或經(jīng)體外擴(kuò)增后用于抗原特異的T細(xì)胞過繼免疫治療[17]。

此外，還有一些其他類型的pMHC多聚體，如基于NTA-Ni2+與帶組氨酸標(biāo)簽的pMHC形成的可逆聚化多聚體[18]；使用脫硫生物素制備的pMHC四聚體在低溫時(shí)具有良好穩(wěn)定性和染色效果，當(dāng)溫度升高尤其是有生物素存在時(shí)可解離形成單體[19]；基于量子點(diǎn)的pMHC多聚體也被用于抗原特異的T細(xì)胞表型分析[20]。

3 pMHC多聚體的應(yīng)用

自從Altman等在1996年設(shè)計(jì)出實(shí)用的抗原特異性T細(xì)胞標(biāo)記分子工具以來，pMHC多聚體迅速成為T細(xì)胞分析和操作的金標(biāo)準(zhǔn)，以熒光標(biāo)記的pMHC多聚體染色對(duì)應(yīng)T細(xì)胞的方式被廣泛應(yīng)用于抗原特異的T細(xì)胞的檢測(cè)、觀察、計(jì)數(shù)、表型分析和分離等[21-26]。

pMHC多聚體也可用于檢測(cè)TCR和MHC之間的結(jié)合力。一般多聚體染色的強(qiáng)度和TCR/MHC親和力成正比[27]。TCR和MHC的解離速率可以通過四聚體衰變(Tetramer decay)的方法測(cè)量[28]，熒光四聚體染色的T細(xì)胞在封閉抗體的作用下，四聚體逐漸從T細(xì)胞解離下來，通過流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度變化，可計(jì)算出解離速率。

近年來，過繼T細(xì)胞治療(Adoptive T cell therapy)作為一種有效的癌癥治療方法引起廣泛關(guān)注[29]，該方法通過將體外擴(kuò)增的抗原特異性自體T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)達(dá)到治療目的。Yee等報(bào)道了利用pMHC四聚體染色技術(shù)從患者外周血中分離抗原特異的T細(xì)胞并用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的過繼免疫治療[30,31]。由于外周血中抗原特異性T細(xì)胞比例極小，通過體外抗原肽的刺激并結(jié)合IL-21的使用，可以大幅度提高抗原特異性T細(xì)胞的比例。細(xì)胞經(jīng)體外刺激后再經(jīng)過熒光標(biāo)記的pMHC四聚體染色，可使用流式分選儀將抗原陽性的T細(xì)胞分離出來并經(jīng)過體外擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，以達(dá)到治療目的。

此外，pMHC多聚體在監(jiān)控患者接種癌癥疫苗或感染病毒后的T細(xì)胞反應(yīng)中也起到關(guān)鍵作用。 最近有文章報(bào)道使用新抗原(Neo-antigens)免疫癌癥患者的方法[32,33]，免疫后的患者外周血使用新抗原結(jié)合的MHC多聚體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗原特異性T細(xì)胞比例迅速提高，從而證實(shí)免疫起到了良好效果。

pMHC多聚體在癌癥特異性抗原肽發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證上也起著重要作用。通過質(zhì)譜鑒定[34]或者預(yù)測(cè)[35]的方法篩選抗原肽并制備成相應(yīng)的MHC多聚體，應(yīng)用多聚體染色和流式細(xì)胞分選技術(shù)將外周血或者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T細(xì)胞分離出來，最后通過一系列功能實(shí)驗(yàn)對(duì)抗原肽作進(jìn)一步驗(yàn)證。癌癥特異的抗原肽發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證為癌癥免疫治療提供更多特異性的靶點(diǎn)，具有重要意義。

4 pMHC多聚體之間的比較

pMHC四聚體由于最先被報(bào)道用于體外抗原特異性T細(xì)胞分析，能夠檢測(cè)和分離外周血中少量存在的抗原特異的T細(xì)胞，具有廣泛的適用性，另一方面，四聚體能方便容易地在實(shí)驗(yàn)室制備，只需要基礎(chǔ)的蛋白表達(dá)和純化設(shè)備即可，因此四聚體也是目前仍然被廣泛使用的多聚體類型[36]。五聚體由于包含5個(gè)朝向相同的pMHC復(fù)合物，相比于四聚體的四面體結(jié)構(gòu)，具有更強(qiáng)的TCR相互作用親合力，同時(shí)，五聚體允許被高達(dá)5個(gè)的熒光分子標(biāo)記，因此也具有比四聚體更亮的信號(hào)[10]。Dextramers由于包含更多數(shù)量的pMHC和熒光分子，具有比四聚體更明亮的染色，同時(shí)在低親和力的TCR-pMHC相互作用以及Ⅱ型pMHC染色方面，dextramers表現(xiàn)更勝一籌[36]。使用包含馬來酰胺的烷基化試劑進(jìn)行生物素化的方法制備的八聚體比四聚體具有更高的T細(xì)胞結(jié)合能力，同時(shí)，通過烷基化試劑制備的多聚體與傳統(tǒng)的四聚體相比，生物素化過程中烷基化形成的硫醚鍵比BirA生物素連接酶形成的酰胺鍵更加穩(wěn)定，不易于被蛋白酶類和化學(xué)降解[13]。

十二聚體在抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)、分離和表型分析上比四聚體更加靈敏和多用途。例如，在人類和小鼠CD4+和CD8+αβ T細(xì)胞組分中，十二聚體能夠檢測(cè)出比四聚體多2至5倍的抗原特異的T細(xì)胞。在低親和力的T細(xì)胞檢測(cè)上，十二聚體也表現(xiàn)更靈敏，能夠檢測(cè)早期的CD4+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞，而這些細(xì)胞中T細(xì)胞受體的密度比成熟T細(xì)胞低10～30倍；在稀有的γδ T 細(xì)胞分析上十二聚體也表現(xiàn)出更多實(shí)用性。此外，由于十二聚體比四聚體具有更強(qiáng)的結(jié)合能力并且解離速度更慢，在單細(xì)胞質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用上具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)用于抗原特異性T細(xì)胞染色時(shí)，十二聚體的熒光強(qiáng)度是四聚體的5倍多；同時(shí)，在4℃染色時(shí)，具有與四聚體相當(dāng)?shù)淖畹腿旧尘?。與Dextramer相比，在使用相同濃度熒光標(biāo)記的SA時(shí)，十二聚體的熒光強(qiáng)度比Dextramer稍強(qiáng)[15]。

在抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè)和分離過程中，多聚體的存在可能導(dǎo)致延長(zhǎng)的T細(xì)胞受體信號(hào)以及隨后的T細(xì)胞功能改變。Neudorfer 等闡述了基于Streptamer的分選技術(shù)。在人類T淋巴細(xì)胞分選上，Streptamer具有與傳統(tǒng)四聚體相似的特異度和靈敏度，但Streptamer完全可逆。與傳統(tǒng)的四聚體相比，Streptamer從細(xì)胞上解離后，抗原特異性T細(xì)胞仍然保持功能活性，以致于在一定情況下可直接將pMHC多聚體分選出的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到特定條件的患者。Streptamer在轉(zhuǎn)移前能從T細(xì)胞上解離下來，避免了直接針對(duì)pMHC多聚體試劑的免疫反應(yīng)[16]。使用磁珠偶聯(lián)的Streptamer也更適用于GMP水平[37]。MHC-streptamer技術(shù)對(duì)于使用抗原特異的T細(xì)胞群體進(jìn)行的過繼免疫治療的發(fā)展具有重要促進(jìn)作用。Histamers是Tischer等發(fā)展出來的另一個(gè)新型可逆化多聚體。Histamers同樣能分選出高純度和特異性T細(xì)胞而不改變T細(xì)胞群體的功能狀態(tài)。與Streptamer不同的是可直接使用免疫磁珠分離的方法將抗原特異性T細(xì)胞分選出來。Histamers在觀察和分離抗原特異性細(xì)胞的效率上與五聚體相似[17]。

5 結(jié)語

pMHC多聚體現(xiàn)已是免疫學(xué)研究的常規(guī)工具。在進(jìn)行抗原特異性T細(xì)胞標(biāo)記染色時(shí)，一方面，pMHC多聚體染色對(duì)應(yīng)T細(xì)胞的能力與單體的pMHC/TCR相互作用半衰期相關(guān)。另一方面，對(duì)于使用給定的pMHC多聚體進(jìn)行特定的T細(xì)胞染色強(qiáng)依賴于特定的染色條件以及被染色時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)，Wooldridge等[38]和Dolton等[39]對(duì)pMHC多聚體染色的影響因素和技巧作了詳細(xì)的闡述。近年來，多色流式細(xì)胞術(shù)以及質(zhì)譜串聯(lián)流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，也為抗原特異性T細(xì)胞的分析提供了重要支撐[40]。在實(shí)際應(yīng)用中，我們可根據(jù)T細(xì)胞標(biāo)記染色時(shí)的TCR/pMHC親和力選擇恰當(dāng)?shù)膒MHC多聚體形式；用于抗原特異性T細(xì)胞的分離、克隆并用于過繼免疫治療時(shí)，使用可逆的pMHC多聚體更能保留T細(xì)胞的功能。

在抗原特異性T細(xì)胞染色方面，pMHC多聚體也存在一個(gè)主要問題：pMHC多聚體染色對(duì)應(yīng)T細(xì)胞所需要的TCR-pMHC親和力閾值超出了T細(xì)胞被pMHC激活所需的親和力閾值，以致于不能檢測(cè)出所有的能應(yīng)答特定pMHC的T細(xì)胞。這種情況尤其存在于染色抗腫瘤的T細(xì)胞、自身免疫細(xì)胞以及Ⅱ類MHC限制的T細(xì)胞時(shí)[39]。雖然到目前為止，使用一些染色技巧，如在蛋白激酶抑制劑(PKI)存在下染色[41]、使用高價(jià)的pMHC多聚體[36]以及使用抗多聚體的抗體增強(qiáng)染色信號(hào)等[42]，我們已能將染色T細(xì)胞所需的pMHC/TCR相互作用親和力大大提升(KD>10-3M)，但仍不能保證這種提升能使pMHC多聚體達(dá)到染色所有有功能的T細(xì)胞的程度[39]。

近年來，基于pMHC多聚體技術(shù)的抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)有了新突破，由于受限于熒光分子及金屬標(biāo)簽的種類限制，使得使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或質(zhì)譜偶聯(lián)細(xì)胞計(jì)數(shù)能在單個(gè)樣品中同時(shí)檢測(cè)的抗原應(yīng)答T細(xì)胞數(shù)量有限，Bentzen等利用“DNA條碼”標(biāo)記的pMHC多聚體實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)，能在單一樣品中同時(shí)篩查>1 000種的抗原多肽特異性。這種技術(shù)能將功能性的T細(xì)胞分析與大規(guī)模的抗原表位識(shí)別譜結(jié)合在一起，在各種疾病的T細(xì)胞識(shí)別表征中發(fā)揮重要作用[7]。隨著免疫治療和精準(zhǔn)治療的火熱，pMHC多聚體技術(shù)在抗原特異的T細(xì)胞分析中仍將發(fā)揮著重要作用，新技術(shù)的發(fā)展也將擴(kuò)展至更多方面的應(yīng)用。

[1] Bentzen AK,Hadrup SR.Evolution of MHC-based technologies used for detection of antigen-responsive T cells[J].Cancer Immunol Immunother,2017,66(5):657-666.

[2] Corr M,Slanetz AE,Boyd LF,etal.T cell receptor-MHC class I peptide interactions:affinity,kinetics,and specificity[J].Science,1994,265(14):946-949.

[3] Altman JD,Moss PAH,Goulder PJ,etal.Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes[J].Science,1996,274(5284):94-96.

[4] Goldberg AC,Rizzo LV.MHC structure and function - antigen presentation.Part 1[J].Einstein (Sao Paulo),2015,13(1):153-156.

[5] Tario J JD,Chen GL,Hahn TE,etal.Dextramer reagents are effective tools for quantifying CMV antigen-specific T cells from peripheral blood samples[J].Cytometry B Clin Cytom,2015,88(1):6-20.

[6] Newell EW,Sigal N,Bendall SC,etal.Cytometry by time-of-flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+T cell phenotypes evan[J].Immunity,2012,36(1):142-152.

[7] Bentzen AK,Marquard AM,Lyngaa R,etal.Articles Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes[J].Nat Biotechnol,2016,34(10):1037-1045.

[8] Dal Porto J,Johansen TE,Catipovic B,etal.A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations.[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1993,90(14):6671-6675.

[9] Casalegno-Garduo R,Schmitt A,Yao J,etal.Multimer technologies for detection and adoptive transfer of antigen-specific T cells[J].Cancer Immunol Immunother,2010,59(2):195-202.

[10] Duplan V,Suberbielle E,Napper CE,etal.Tracking antigen-specific CD8+T cells in the rat using MHC class I multimers[J].J Immunol Methods,2007,320(1-2):30-39.

[11] Batard P,Peterson DA,Devêvre E,etal.Dextramers:New generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+T cells[J].J Immunol Methods,2006,310(1-2):136-148.

[12] Bethune MT,Comin-Anduix B,Hwang Fu YH,etal.Preparation of peptide-MHC and T-cell receptor dextramers by biotinylated dextran doping[J].Biotechniques,2017,62:123-130.

[13] Guillaume P,Legler DF,Boucheron N,etal.Soluble major histocompatibility complex-peptide octamers with impaired CD8 binding selectively induce Fas-dependent apoptosis[J].J Biol Chem,2003,278(7):4500-4509.

[14] Howarth M,Chinnapen DJ,Gerrow K,etal.A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site[J].Nat Methods,2006,3(4):267-273.

[15] Huang J,Zeng X,Sigal N,etal.Detection,phenotyping,and quantification of antigen-specific T cells using a peptide-MHC dodecamer[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(13):1890-1897.

[16] Neudorfer J,Schmidt B,Huster KM,etal.Reversible HLA multimers (Streptamers) for the isolation of human cytotoxic T lymphocytes functionally active against tumor- and virus-derived antigens[J].J Immunol Methods,2007,320(1-2):119-131.

[17] Tischer S,Kaireit T,Figueiredo C,etal.Establishment of the reversible peptide-major histocompatibility complex (pMHC) class I Histamer technology:Tool for visualization and selection of functionally active antigen-specific CD8+T lymphocytes[J].Int Immunol,2012,24(9):561-572.

[18] Schmidt J,Guillaume P,Irving M,etal.Reversible major histocompatibility complex I-peptide multimers containing Ni2+-nitrilotriacetic acid peptides and histidine tags improve analysis and sorting of CD8+T cells[J].J Biol Chem,2011,286(48):41723-41735.

[19] Guillaume P,Baumgaertner P,Angelov GS,etal.Fluorescence-activated cell sorting and cloning of bona fide CD8+CTL with reversible MHC-peptide and antibody Fab′ conjugates[J].J Immunol,2006,177(6):3903-3912.

[20] Chattopadhyay PK,Price Da,Harper TF,etal.Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry[J].Nat Med,2006,12(8):972-977.

[21] Yee C,Savage PA,Lee PP,etal.Isolation of high avidity melanoma-reactive ctl from heterogeneous populations using peptide-MHC tetramers[J].J Immunol,1999,162:2227-2234.

[22] Meyer AL,Trollmo C,Crawford F,etal.Direct enumeration of Borrelia-reactive CD4 T cells ex vivo by using MHC class II tetramers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(21):11433-11438.

[23] Micha?lsson J,Achour A,Salcedo M,etal.Visualization of inhibitory Ly49 receptor specificity with soluble major histocompatibility complex class I tetramers[J].Eur J Immunol,2000,30:300-307.

[24] Mulder A,Eijsink C,Kardol MJ,etal.Identification,isolation,and culture of HLA-A2-specific B lymphocytes using MHC Class I tetramers[J].J Immunol,2003,171:6599-6603.

[25] W?lfl M,Schalk S,Hellmich M,etal.Quantitation of MHC tetramer-positive cells from whole blood:evaluation of a single-platform,six-parameter flow cytometric method[J].Cytometry A,2004,57A:120-130.

[26] James EA,LaFond R,Durinovic-Bello I,etal.Visualizing antigen specific CD4+T cells using MHC class II tetramers[J].J Vis Exp,2009,25:e1167.

[27] Zhong S,Malecek K,Johnson LA,etal.T-cell receptor affinity and avidity defines antitumor response and autoimmunity in T-cell immunotherapy[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(17):6973-6978.

[28] Malecek K,Zhong S,McGary K,etal.Engineering improved T cell receptors using an alanine-scan guided T cell display selection system[J].J Immunol Methods,2013,392(1-2):1-11.

[29] Restifo NP,Dudley ME,Rosenberg SA.Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing the T cell response[J].Nat Rev Immunol,2012,12(4):269-281.

[30] Hunder NN,Wallen H,Cao J,etal.Treatment of metastatic melanoma with autologous CD4+T cells against NY-ESO-1[J].N Engl J Med,2008,358(25):2698-2703.

[31] Pollack SM,Jones RL,Farrar EA,etal.Tetramer guided,cell sorter assisted production of clinical grade autologous NY-ESO-1 specific CD8(+) T cells[J].J Immunother Cancer,2014,2(1):36.

[32] Sahin U,Derhovanessian E,Miller M,etal.Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer[J].Nature,2017,547(7662):222-226.

[33] Ott PA,Hu Z,Keskin DB,etal.An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J].Nature,2017,547(7662):217-221.

[34] Bassani-Sternberg M,Coukos G.Mass spectrometry-based antigen discovery for cancer immunotherapy[J].Curr Opin Immunol,2016,41:9-17.

[35] Snyder A,Chan TA.Immunogenic peptide discovery in cancer genomes[J].Curr Opin Genet Dev,2015,30:7-16.

[36] Dolton G,Lissina A,Skowera A,etal.Comparison of peptide-major histocompatibility complex tetramers and dextramers for the identification of antigen-specific T cells[J].Clin Exp Immunol,2014,177(1):47-63.

[37] Wang X,Pang H,Xu X,etal.Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells[J].J Formos Med Assoc,2013,112(6):338-345.

[38] Wooldridge L,Lissina A,Cole DK,etal.Tricks with tetramers:how to get the most from multimeric peptide-MHC[J].Immunology,2009,126(2):147-164.

[39] Dolton G,Tungatt K,Lloyd A,etal.More tricks with tetramers:A practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers[J].Immunology,2015,146(1):11-22.

[40] Bacher P,Scheffold A.Flow-cytometric analysis of rare antigen-specific T cells[J].Cytometry A,2013,83A:692-701.

[41] Lissina A,Ladell K,Skowera A,etal.Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers[J].J Immunol Methods,2009,340(1):11-24.

[42] Tungatt K,Bianchi V,Crowther MD,etal.Antibody stabilization of peptide-MHC multimers reveals functional T cells bearing extremely low-affinity TCRs[J].J Immunol,2015,194(1):463-474.