嚴(yán)匡華 陳 龍 嚴(yán)風(fēng)夢

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，開封 475001)

白血病又稱血癌是一種常見兒童期好發(fā)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是我國主要腫瘤死亡因素之一，其主要特征為造血干細(xì)胞異常增殖、分化、凋亡和造成正常血細(xì)胞減少[1，2]。從2002年～2014年的研究發(fā)現(xiàn)，部分地區(qū)白血病的發(fā)病率和死亡率有明顯上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康[3，4]。目前化療是白血病臨床治療的主要手段，但其往往伴有較大的副作用，尋找安全有效的治療手段一直是研究的熱點[5，6]。微小RNA(miRNA)是一種小分子RNA，在白血病中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的重要作用，研究特定的miRNA可作為白血病診斷和治療的有效靶點[7，8]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達，干擾其表達可達到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的[9，10]。目前，關(guān)于miR-21在白血病中的作用機制尚不明確，本實驗通過下調(diào)miR-21的表達，觀察其對白血病K562細(xì)胞增殖凋亡的影響，及其對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用，探討miR-21在白血病細(xì)胞中可能的作用機制，為白血病的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于浙江四季青公司；白血病細(xì)胞系K562購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，miR-21和內(nèi)參U6的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；miR-21 inhibitor和miR-21 negative control購于廣州銳博生物科技有限公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司；噻唑藍(lán)MTT、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購于美國Sigma公司；兔抗PI3K、p-AKT、AKT、β-actin抗體和羊抗兔HRP酶標(biāo)記的IgG購于美國Santa Cruz公司；流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀均購于美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀購于美國Gibco公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 將K562細(xì)胞培養(yǎng)中含有10%胎牛血清和青鏈酶雙抗(100 U/ml青霉素+100 μg/ml 鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)基上，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，分為對照組(不做任何處理)和miR-21 NC組(加入120 nmol/L miR-21 negative control+脂質(zhì)體)和miR-21干擾組(120 nmol/L miR-21 inhibitor+脂質(zhì)體)3組。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的說明書將上述各組細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換成完全培養(yǎng)基，在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-21 mRNA的表達 收集上述轉(zhuǎn)染48 h的各組K562細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒的說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，BCA法檢測其濃度和純度后，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照GenBank中miR-21序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計目的基因miR-21及內(nèi)參基因U6的RT-PCR引物，以cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃總延伸5 min。反應(yīng)體系為20 μl，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各組細(xì)胞中miR-21 mRNA表達水平。

1.2.3MTT法檢測K562細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染48 h后的各組K562細(xì)胞，以3×105個/ml濃度接種至96孔板中，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液后在條件為37℃、5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。其中每組實驗均設(shè)5個復(fù)孔，每孔加入新鮮噻唑藍(lán)MTT溶液(濃度為5 mg/ml)20 μl，孵育4 h后加入二甲基亞砜DMSO 200 μl，待充分溶解后用酶標(biāo)儀于570 nm檢測各組細(xì)胞的吸光值(OD)。根據(jù)公式：細(xì)胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD/對照組細(xì)胞OD)×100%,計算各組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個/ml，經(jīng)離心、PBS洗滌和75%乙醇處理后，加入200 μl結(jié)合緩沖液Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC) 5 μl和碘化丙啶(PI)10 μl，避光處理30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western blot檢測信號通路PI3K/AKT中相關(guān)蛋白的表達 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，加裂解液提取總蛋白，并采用BCA法檢驗其濃度。取100 μg上清蛋白量進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(12%)電泳，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，經(jīng)脫脂奶粉(5%)封閉2 h后加入兔抗PI3K、p-AKT、AKT和β-actin抗體(稀釋1∶1 000)，孵育4℃過夜，再加入稀釋1∶1 000的二抗羊抗兔HRP酶標(biāo)記的IgG(IgG-HRP)，孵育2 h后，以化學(xué)發(fā)光法顯色，用凝膠電泳成像儀采集圖像。以β-actin為內(nèi)參，采用Quantity One軟件分析條帶。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-21的相對表達水平 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組K562細(xì)胞中miR-21的表達結(jié)果見圖1，對照組、miR-21 NC組和miR-21干擾組細(xì)胞中miR-21的相對表達水平分別為(1.00±0.03)、(0.98±0.05)和(0.32±0.05)。與對照組相比，miR-21 NC組細(xì)胞中miR-21的表達水平無明顯變化(P>0.05)，而miR-21干擾組細(xì)胞中miR-21的表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2下調(diào)miR-21對白血病細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，對照組、miR-21 NC組和miR-21干擾組K562細(xì)胞的存活率分別為(100.18±2.15)%、(97.32±3.62)%和(52.45±5.25)%。結(jié)果如圖2表明，與對照組相比，miR-21 NC組中細(xì)胞存活率的差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而miR-21干擾組中細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05)，表明下調(diào)miR-21的表達后明顯抑制了K562細(xì)胞的增殖。

2.3下調(diào)miR-21對白血病細(xì)胞周期的影響 表1顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染48 h后miR-21干擾組細(xì)胞中G0/G1期所占細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，S期細(xì)胞所占比例顯著下降(P<0.05)，而miR-21 NC組細(xì)胞中各細(xì)胞周期變化不明顯(P>0.05)。結(jié)果說明下調(diào)miR-21的表達可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。

2.4下調(diào)miR-21對白血病細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞的凋亡結(jié)果見圖3對照組、miR-21 NC組和miR-21干擾組中細(xì)胞的凋亡率分別為(6.78±2.25)%、(7.36±3.22)%和(35.42±2.25)%。miR-21 NC組細(xì)胞的凋亡率與對照組相比差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而miR-21干擾組細(xì)胞的凋亡率較對照組明顯升高(P<0.05)。說明下調(diào)miR-21能夠促進K562細(xì)胞凋亡。

2.5下調(diào)miR-21抑制PI3K/AKT信號通路 轉(zhuǎn)染miR-21 48 h后，檢測各組K562細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路中PI3K、AKT和磷酸化AKT蛋白的表達情況，結(jié)果見表2、圖4。與對照組相比，miR-21NC組細(xì)胞中PI3K、t-AKT和p-AKT蛋白的相對表達水平差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而miR-21干擾組中PI3K和t-AKT的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但p-AKT的表達水平明顯下降(P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-21的相對表達水平Fig.1 Relative expression levels of miR-21 in cells after transfectionNote:Compared with control,*.P<0.05.

圖2 下調(diào)miR-21對白血病K562細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of down regulation of miR-21 expression on proliferation of leukemic K562 cellsNote:Compared with control,*.P<0.05.

GroupsG0/G1SG2/MControl56 08±1 8632 25±1 0611 88±1 25miR?21NC57 16±2 352)31 52±2 552)11 76±1 122)miR?21interference69 86±2 111)20 21±1 121)10 02±2 021)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with control,2)P>0.05.

圖3 下調(diào)miR-21表達對K562細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of down regulation of miR-21 expression on apoptosis of K562 cellsNote:A.Control group；B.miR-21 NC group；C.miR-21 interference group.

GroupsPI3Kp?AKTt?AKTControl0 41±0 030 18±0 020 52±0 03miR?21NC0 42±0 052)0 16±0 032)0 51±0 042)miR?21interference0 38±0 051)0 07±0 031)0 49±0 051)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with control,2)P>0.05.

圖4 下調(diào)miR-21表達對PI3K/AKT信號通路的影響Fig.4 Effect of down regulation of miR-21 expression on PI3K/AKT signaling pathway

3 討論

miR-21是一種廣泛存在的定位于17q23.2染色體中FRA17B常見脆性區(qū)域上的miRNA[11]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在膠質(zhì)瘤、乳腺癌和宮頸癌等多種腫瘤中出現(xiàn)高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，作為腫瘤標(biāo)志物對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評估具有很大的臨床應(yīng)用價值[12-14]。如Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-21作為致癌基因在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，并認(rèn)為miR-21可能作為判斷患者預(yù)后不良的指標(biāo)；Bao等[16]檢測miR-21在結(jié)腸癌及其相應(yīng)癌旁正常組織的表達發(fā)現(xiàn)，miR-21在結(jié)腸癌中的表達水平較其癌旁正常組織明顯上調(diào)，并認(rèn)為其表達與結(jié)腸癌的發(fā)病位置、臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。白血病是一種嚴(yán)重威脅兒童生命的惡性腫瘤，其發(fā)病機理仍不清晰，有研究發(fā)現(xiàn)miR-21在急性B淋巴細(xì)胞白血病中異常表達，與白血病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[17]，但關(guān)于miR-21與白血病的作用機制尚不明確，研究miR-21在白血病中的作用機制對白血病的診斷和治療具有重要意義。

周克兵等[18]發(fā)現(xiàn)下調(diào)鼻咽癌中高表達的miR-21后，可有效抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖和侵襲。Yu等[19]在miR-21對腎癌細(xì)胞凋亡和侵襲力的影響研究中發(fā)現(xiàn)沉默miR-21可抑制腎癌的惡性發(fā)展。為了探討miR-21在白血病中的作用機制，本實驗通過脂質(zhì)體法下調(diào)miR-21的表達，觀察其對白血病K562細(xì)胞增殖凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21的表達能夠明顯抑制K562細(xì)胞的增殖，同時使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并促進細(xì)胞凋亡。此結(jié)果進一步證明了Wu等[20]得出抑制miR-21表達能夠抑制白血病細(xì)胞增殖的實驗結(jié)果，但本研究也發(fā)現(xiàn) miR-21的表達可調(diào)控白血病K562細(xì)胞周期，此結(jié)果與Xiong等[21]研究抑制miR-21的表達可影響結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期的結(jié)果相吻合。

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)的激活能夠促進細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，蛋白激酶B(PKB又稱AKT)是PI3K下游重要的靶激酶，兩者均為PI3K/AKT信號通路的重要組成部分，在多種腫瘤疾病中發(fā)揮著重要作用[22，23]。PI3K/AKT在白血病中發(fā)揮著重要的調(diào)控機制，與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24，25]。Mu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-21的表達可以抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中PI3K/AKt信號通路；Wang等[27]也發(fā)現(xiàn)沉默miR-21通過阻斷PI3K/AKT信號通路來誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞凋亡。為了進一步了探討下調(diào)miR-21對白血病細(xì)胞凋亡的機制，觀察其對白血病細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路的影響，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)p-AKT的表達水平較對照組和miR-21 NC組明顯下降，但PI3K和AKT蛋白的表達水平變化不大。

綜上所述，下調(diào)miR-21能夠抑制白血病K562細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，促進其凋亡，其作用機制可以與抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)，本研究為以miR-21為分子靶點治療白血病的實驗研究提供了理論參考。

[1] Zhang QX,Cai WL,Yan PK,etal.Research progress of traditional chinese medicine in the treatment of leukemia[J].J Liaoning Uni TCM,2015,17(9):110-113.

[2] Chen WQ,Zhang SW,Zheng RS.Report of cancer incidence and mortality in China,2012[J].China Cancer,2016,25(1):1-8.

[3] Wang LH,Zheng WU,Yan B.Incidence and mortality of leukemia in shanghai pudong new area,2002-2012[J].Chin J Public Health,2016,32(11):1547-1550.

[4] Hu WB，Zhang T，Qin W，etal.Trend of leukemia incidence and mortality in kunshan city，jiangsu province，2006～2014[J].China Cancer,2017,26(1):38-43.

[5] Shi YY,Ma CY,Miao YJ,etal.Mechanisms of Chinese materia medica multi-target to reverse MDR of leukemia[J].Chin Traditional Herbal Drugs,2016,47(7):1230-1235.

[6] Wang F,Chen H.Overview of the treatment of leukemia with genetic engineering drugs[J].J Modern Oncol,2013,21(5) :1158-1162.

[7] 金愛琴,倪紅兵,孫寶蘭,等.microRNA-218在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞CCRF-CEM中的作用及機制研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2015,31(1):103-108.

Jin AQ,Ni HB,Sun BL,etal.Roles and regulation mechanism of microRNA-218 in acute lymphocytic leukemia cell CCRF-CEM[J].Chin J Immunl,2015,31(1):103-108.

[8] Wang P,Zhang X,Pediatrics DO.The clinical significance of detection of miR-223 and miR-99a in children with acute myeloid leukemia[J].Hebei Med J,2016,38(16):2416-2418.

[9] Wan RQ,Fu XJ,Zhang XH,etal.Expression of miR-21 in nasopharyngeal carcinoma and its effect on proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Chin J Otorhinolaryngology-Skull Base Surg,2015,21(5):377-382.

[10] Tian M,Wang YS,Miao LY,etal.Effects of miR-21 inhibition on A549/DDP cisplatin resistant cell proliferation and apoptosis in non-small cell lung cancer[J].Acta Universitatis Medicianlis nanjing(Natural Science),2014,34(5):543-547.

[11] Liang Y.Research advances of miR-21 and tumor[J].Chin J Cancer Prevention Treatment,2012,9(12):949-952.

[12] Li QL,Song YW,Hui LI,etal.The latest progress in research and therapy of miR-21 in glioma[J].Med Recapitulate,2015,2013(1):295-300.

[13] Zhang H,Zhang Y,Zou L.Advances in research on miR-21 and breast cancer[J].J Biomedical Engineer,2015,32(3):712-716.

[14] Liu J,Wang YL,Huang LM.Research progress on the relationship between miR-21 and cervical cancer[J].Hainan Med J,2015,26(19):2885-2888.

[15] Zhang TL,Sun L,Wang SM,etal.Expression of miR-21 in multiple myeloma and its clinical significance[J].J Exp Hematol,2012,20(3):616-619.

[16] Bao X,Yang YM,Liu N,etal.Expressions of miR-21 in colon cancer and cancer-adjacent colorectal tissues and their clinical significances[J].J Jilin Uni Med Edition,2013,39(2):318-321.

[17] Liu X,Shuhong YU,Sun L,etal.The expression and its significance of miR-21 in children with acute B-lymphocytic lekemia[J].Med J Qilu,2014,29(1):1-3.

[18] 周克兵,谷 剛,曹 昕.下調(diào)miR-21表達抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖和侵襲[J].中國癌癥雜志,2013,23(11):863-867.

Zhou KB,Gu G,Cao X. miR-21 downregulation attenuates cell proliferation,migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma[J]. China Oncol,2013,23(11):863-867.

[19] Yu NW,Zhang AM,Hao JW,etal.Impact of MiR-21 on apoptosis and invasion in renal cell carcinoma[J].Progress Modern Biomed,2013,13(4):636-638.

[20] Wu GF,Huang QT,Zeng YT,etal.miR-21 inhibits migration and proliferation of leukemic K562 cells via the PTEN/AKT pathway[J].J Med Postgraduates,2013,26(10):1037-1040.

[21] Xiong BH,Ma L,Cheng Y,etal.Impact of inhibition of miRNA-21 on biological functions of colorectal cancer cells[J].Chin J Cancer Biother,2014,21(1):49-54.

[22] Wei LT,Feng J,Mo SR.Progress in correlation of PI3K-akt signal pathway with tumor[J].J Chin Oncol,2014,20(4):331-336.

[23] 段友強,劉義鋒,李 巍.奧沙利鉑調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87生長的作用研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2017,33(3):328-332.

Duan YQ,Liu YF,Li W. Research of oxaliplatin inhibit growth in glioma U87 cells by regulating PI3K/ Akt signal pathway[J].Chin J Immunl,2017,33(3):328-332.

[24] Wang WL,Zhang YC,Zeng HM,etal.Regulatory mechanisms of PI3K/AKT signaling pathway in acute leukemia[J].J Exp Hematol,2012,20(1):18-21.

[25] Hu C,Xu M,Qin R,etal.Wogonin induces apoptosis and endoplasmic reticulum stress in HL-60 leukemia cells through inhibition of the PI3K-AKT signaling pathway[J].Oncol Rep,2015,33(6):3146-3154.

[26] Mu SZ,Sun YW,Wang GD.Down-regulation of miR-21 inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways via PDCD4[J].Chin J Aesthetic Med,2015,24(23):39-43.

[27] Wang WZ,Pu QH,Lin XH,etal.Silencing of miR-21 sensitizes CML CD34+,stem/progenitor cells to imatinib-induced apoptosis by blocking PI3K/AKT pathway[J].Leukemia Res,2015,39(10):1117-1124.