馬金昀 王金英 孫 宇 李國(guó)陵 程曉東

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床免疫研究所，上海 200437)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種由自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其最經(jīng)典和最成熟的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)[1]。MS/EAE以自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化、炎癥、髓鞘脫失及神經(jīng)元損傷和缺失為主要病變特點(diǎn)[2]。MS/EAE的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia,MG)活化釋放大量前炎癥因子和毒性介質(zhì)，發(fā)起炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥范圍和神經(jīng)損傷程度，在MS/EAE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[3,4]。程序性細(xì)胞死亡配體(Programmed death ligands,PD-Ls)為B7-CD28超家族的新成員，表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞上，與表達(dá)在T細(xì)胞上的受體——程序性細(xì)胞死亡分子-1(Programmed death-1，PD-1)相互結(jié)合并作用，發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用,對(duì)調(diào)控機(jī)體自身免疫反應(yīng)至關(guān)重要[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，炎癥反應(yīng)時(shí)其表面的PD-L1表達(dá)升高，說(shuō)明其在CNS炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。中藥黃芪具有補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)舉陷、固表止汗等功效，臨床上運(yùn)用黃芪治療神經(jīng)退行性疾病有著悠久的歷史，長(zhǎng)期以來(lái)已進(jìn)行了許多富有成效的探索[7-9]。本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，黃芪對(duì)小鼠EAE具有明顯的治療作用，可以明顯改善EAE癥狀，抑制MOG誘導(dǎo)的脾臟T細(xì)胞增殖，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17水平，增加抗炎細(xì)胞因子IL-4水平，減輕小鼠CNS炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和髓鞘脫失[10]。黃芪多糖(Astragals polysaccharides，APS)作為黃芪的主要有效成分，既有免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)也存在免疫抑制作用，能雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能[11]。因此，為了進(jìn)一步探索黃芪治療EAE的神經(jīng)免疫調(diào)控機(jī)制，在前期工作基礎(chǔ)上，本研究將觀察黃芪有效成分APS對(duì)小鼠EAE的治療作用，以及對(duì)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子調(diào)控機(jī)制，以揭示APS的中樞神經(jīng)免疫藥理學(xué)機(jī)制，探尋其治療多發(fā)性硬化的新靶點(diǎn)，為治療神經(jīng)退行性疾病提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，8～9周齡，體重18～20 g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)單位許可證號(hào)SCSK(滬2007-0005)；飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYSK(滬2009-0022)。BV-2小鼠小腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，購(gòu)于上海復(fù)祥生物科技有限公司；LPS購(gòu)于Sigma公司；APS購(gòu)于西安鴻生生物技術(shù)有限公司，純度70%(批號(hào)111013)；髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白MOG35-55多肽由上海吉爾生化有限公司合成Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys，縮寫(xiě)MEVGWYRSPFSRVVHLYRN-GK，純度>98%；完全弗氏佐劑CFA購(gòu)于Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌H37Ra(TB)購(gòu)于BD公司；百日咳毒素(PT)購(gòu)于Calbiochem公司；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自HyClone公司；TNF-α檢測(cè)試劑盒、IFN-γ檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D公司；PD-L1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海嘉碩生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、Broadford法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自生工生物工程有限公司；SDS-PAGE上樣緩沖液、廣譜彩虹預(yù)染Marker、eECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(增強(qiáng)版)購(gòu)自天根生化科技有限公司；抗小鼠PD-L1單克隆抗體、抗小鼠β-actin抗體購(gòu)自上海睿迪生物科技有限公司；噻唑藍(lán)MTT、DMSO 購(gòu)自Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自HyClone公司；75%酒精購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模、分組及給藥觀察 小鼠造模：MOG35-55溶于PBS緩沖液，終濃度2 mg/ml；在CFA中加入TB至終濃度5 mg/ml；MOG35-55溶液與CFA按體積1∶1 進(jìn)行乳化，PT溶液的配制：將0.2 mg/ml PT用PBS緩沖液稀釋至1 000 ng/ml；在免疫當(dāng)日(d 0)乙醚麻醉小鼠，于背部脊柱兩側(cè)分兩點(diǎn)注射MOG35-55乳化劑200 μg/只，腹腔注射PTX溶液200 ng/只，并觀察小鼠麻醉后蘇醒狀態(tài)是否良好；在免疫后第2天(d 2)再次腹腔注射PT 200 ng/只。EAE小鼠癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國(guó)際通用的5級(jí)評(píng)分法[12]：無(wú)異常表現(xiàn)0分；部分尾部癱瘓0.5分；尾部完全癱瘓1分；后肢輕度癱瘓或步態(tài)不穩(wěn)2分；后肢完全癱瘓3分；雙后肢完全癱瘓，前肢輕度癱瘓3.5分；四肢完全癱瘓4分；瀕死狀態(tài)4.5分；死亡5分。小鼠分組及給藥：實(shí)驗(yàn)前將所有小鼠稱(chēng)重，以g為單位根據(jù)體重分層，按順序隨機(jī)抽取各層小鼠，分為3組：a.正常組，蒸餾水0.2 ml/d灌胃，n=5；b.EAE組，蒸餾水0.2 ml/d灌胃，n=15；c. APS組，予APS 500 mg/(kg·d)灌胃，從免疫當(dāng)日起直至觀察終點(diǎn)，n=15。根據(jù)EAE小鼠癥狀評(píng)分觀察APS的藥效。

1.2.2BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及活化模型的建立 BV-2細(xì)胞培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基：79%RPMI1640+20%滅活血清+1%青-鏈霉素雙抗，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2。活化模型建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞，離心后棄上清，重懸細(xì)胞，稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞密度為104個(gè)/ml。取出6孔板，每孔加入2 ml細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出后加入不同濃度的LPS(用PBS溶液配備)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，然后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性及毒性：活細(xì)胞數(shù)目與生成的藍(lán)色結(jié)晶物甲瓚數(shù)量呈正比例關(guān)系，甲瓚在二甲基亞砜(DMSO)中溶解顯色，根據(jù)顯色程度可知甲瓚的數(shù)量，從而反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)目，進(jìn)而了解細(xì)胞增殖的情況。

1.2.3細(xì)胞分組及給藥 設(shè)置對(duì)照組、LPS組、APS組、LPS+APS組，APS設(shè)置不同濃度。APS溶液的配置：稱(chēng)取1 g APS，溶解于50 ml PBS溶液中，制成20 mg/ml的APS母液，經(jīng)濾器過(guò)濾除菌后保存于4℃冰箱。使用前用無(wú)菌PBS稀釋至指定濃度。

1.2.4ELISA法檢測(cè)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5Western blot法檢測(cè)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞PD-L1的蛋白表達(dá) 采用考馬斯亮藍(lán)法常規(guī)測(cè)定樣品蛋白濃度。經(jīng)SDS PAGE凝膠電泳分離蛋白組份后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF 膜上，經(jīng)5% 脫脂奶粉封閉過(guò)夜后，分別加入不同一抗室溫孵育2 h，再加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，顯色后在成像系統(tǒng)中掃描并分析結(jié)果。

1.2.6Real-time PCR方法檢測(cè)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞PD-L1的mRNA表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所用基因引物合成及擴(kuò)增片段：β-actin:Sense:5′-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3′，Antisense:5′-CGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG-3′；PD-L1:Sense:5′-TTGGGAAATGGA-GGATAAGA-3′，Antisense:5′-GGATGTGCCAGAGGTAGTTCT-3′。采用20 μl 體系，按照試劑盒推薦方案于ABI7500 Real-time PCR儀中進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)，結(jié)果采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1APS對(duì)EAE小鼠癥狀的影響 經(jīng)MOG35-55誘導(dǎo)，EAE模型組小鼠發(fā)病起始于造模后第11天，發(fā)病高峰出現(xiàn)于造模后第16天，16 d后病情逐漸進(jìn)入緩解期；EAE 組小鼠臨床癥狀評(píng)分最高為3.5分，小鼠相繼出現(xiàn)少食、少動(dòng)、精神萎靡、皮毛干枯、尾部癱瘓、后肢無(wú)力、后肢癱瘓、前肢無(wú)力等癥狀；APS組小鼠發(fā)病時(shí)間及發(fā)病高峰期基本與EAE組無(wú)明顯差異，但其高峰期臨床癥狀評(píng)分為1.8分，較未治療組明顯減輕。說(shuō)明APS對(duì)于EAE小鼠的臨床癥狀具有明顯的緩解作用，提示APS可以有效治療EAE(圖1)。

圖1 APS對(duì)EAE小鼠臨床癥狀的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of APS on clinical symptom of EAE mouse

2.2APS對(duì)BV-2細(xì)胞活化作用的影響 通過(guò)文獻(xiàn)資料的查閱，在本研究中選擇了3個(gè)LPS刺激濃度，分別為0.1、1、10 μg/ml，通過(guò)與正常組相比較發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的LPS的刺激下，神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)都發(fā)生了顯著變化。正常組神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞呈分枝狀，胞體小，多為三角形或扁橢圓形，突起長(zhǎng)而纖細(xì)。LPS刺激后的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形，突起數(shù)量減少且短粗，為阿米巴樣神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，其中0.1 μg/ml的LPS刺激后，活化的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞生存率較高。如圖2所示,因此在后面的刺激活化實(shí)驗(yàn)中均采取0.1 μg/ml的LPS。

圖2 不同濃度的LPS對(duì)BV-2細(xì)胞的活化作用Fig.2 Effect of different concertration of LPS on activation of BV-2 cellsNote:A-D.The morphology of the microglia after the intervention of LPS in different concentrations.A.Normal BV-2 cells;B.0.1 μg/ml LPS;C.1.0 μg/ml LPS;D.10 μg/ml LPS.

圖3 APS抑制BV-2細(xì)胞活化Fig.3 APS inhibited BV-2 cell activationNote:A-D.The morphology of the microglia after treatment with APS.A.Normal BV-2 cells;B.0.1 μg/ml LPS;C.0.2 mg/ml APS;D.0.1 μg/ml LPS and 0.2 mg/ml APS.

APS對(duì)活化的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞影響， 圖3A為未經(jīng)LPS活化BV-2細(xì)胞，圖3B為0.1 μg/ml LPS活化BV-2細(xì)胞，圖3C為0.2 mg/ml 的APS直接干預(yù)BV-2細(xì)胞，觀察APS對(duì)未經(jīng)LPS活化的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞影響，圖3D為0.1 μg/ml LPS活化BV-2細(xì)胞后，加入0.2 mg/ml 的APS觀察BV-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，APS組與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯的變化，LPS+APS組與對(duì)照組相比，呈圓形，突起數(shù)量少且短而粗的阿米巴樣神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，但是與LPS組相比較，阿米巴樣神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。由此提示，一定濃度的APS對(duì)于LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞的活化具有明顯的抑制作用，見(jiàn)圖3。

2.3APS對(duì)活化的BV-2細(xì)胞生存活性的影響 如圖2可以看出，3個(gè)LPS刺激濃度都均可以活化神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上可以初步判斷，LPS濃度為0.1 μg/ml時(shí)，細(xì)胞生存活性較高，為了精確驗(yàn)證不同濃度的LPS對(duì)BV-2細(xì)胞生存活性的影響，我們通過(guò)MTT法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在LPS濃度高于0.1 μg/ml時(shí)，細(xì)胞生存活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，LPS的誘導(dǎo)濃度為0.1 μg/ml更適合本研究，如圖4A、表1。

圖4 APS提高活化的BV-2細(xì)胞的生存活性Fig.4 APS increased viability of active BV-2 cellNote:A.The viability of BV-2 cell after the intervention of LPS in different concentrations by MTT;B.The viability of BV-2 cell after the treatment with APS in different concentrations by MTT.Compared with control group,*.P<0.01；compared with LPS group, # .P<0.01.

表1不同濃度LPS對(duì)BV-2細(xì)胞生存活性的影響

Tab.1InfluenceofdifferentconcertrationofLPSonviabilityofBV-2cells

Drugconcentration(μg/ml)2hcellviability(%ofcontrol)BV?2cell0100 00±0 00580 193 92±0 02421)1 085 85±0 03002)10 083 44±0 04262)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with LPS group,2)P<0.01.

表2LPS刺激BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞后其分泌的TNF-α、IFN-γ的水平增加

Tab.2LPSinducedlevelofTNF-αandIFN-γincreasedinBV-2cells

GroupsTNF?α(pg/ml)IFN?γ(pg/ml)Controlgroup218 11±1 95147 75±1 77LPSgroup1028 40±14 681)250 61±2 761)

Note：Compared with control group, 1)P<0.01.

圖5 APS對(duì)活化的BV-2細(xì)胞TNF-α、IFN-γ的分泌水平的影響Fig.5 Influence of APS on expression of TNF-α and IFN-γ in active BV-2 cellsNote:Compared with control group,*.P<0.01；compared with LPS group, #.P<0.01.

通過(guò)文獻(xiàn)查閱和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將APS的作用濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/ml。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS組、APS組、實(shí)驗(yàn)組(LPS+APS組)，結(jié)果顯示，在BV-2細(xì)胞中加入LPS后，細(xì)胞活性明顯下降(P<0.01)，與LPS組相比，實(shí)驗(yàn)組加入APS后有效提升了BV-2細(xì)胞的生存活性(P<0.01)。當(dāng)APS濃度大于0.8 mg/ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，低濃度的APS可以有效提高LPS誘導(dǎo)活化的BV-2細(xì)胞活性，高濃度的APS則不能起到有效地保護(hù)作用。結(jié)果如圖4B所示。

2.4APS對(duì)活化的BV-2細(xì)胞TNF-α、IFN-γ水平的影響 根據(jù)不同濃度的LPS對(duì)BV-2細(xì)胞生存活性的影響實(shí)驗(yàn)，選取LPS的誘導(dǎo)濃度為0.1 μg/ml，干預(yù)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ分泌含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后，LPS組的兩種細(xì)胞因子分泌水平較對(duì)照組明顯升高，如表2所示。用5個(gè)濃度的APS干預(yù)活化后的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，如圖5所示。結(jié)果顯示，當(dāng)APS濃度小于等于0.4 mg/ml時(shí)，APS有效地降低了BV-2活化后釋放的TNF-α、IFN-γ水平(P<0.01)，當(dāng)APS濃度大于0.4 mg/ml時(shí)，將不能降低TNF-α、IFN-γ含量，而且當(dāng)APS濃度大于等于1.0 mg/ml時(shí)，BV-2細(xì)胞上清中TNF-α、IFN-γ含量高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。單獨(dú)用APS干預(yù)的BV-2細(xì)胞上清中，2個(gè)細(xì)胞因子水平無(wú)明顯變化。綜上可得，低濃度的APS能有效地降低LPS活化的BV-2細(xì)胞炎性因子TNF-α、IFN-γ的分泌，對(duì)正常的BV-2起到抗炎保護(hù)作用。高濃度的APS則不具有這種作用，相反，當(dāng)其濃度高到一定程度時(shí)會(huì)增加細(xì)胞炎性因子TNF-α、IFN-γ的分泌。

圖6 APS對(duì)活化的BV-2細(xì)胞PD-L1蛋白水平和mRNA水平表達(dá)的影響Fig.6 Influence of APS on expression of protein and mRNA of PD-L1 in active BV-2 cellsNote:A.PD-L1 protein expression level in active BV-2 cells treated with APS by Western blot;B.Relative PD-L1 protein level;C.Relative PD-L1 mRNA level by Real-time PCR.Compared with control group,*.P<0.05；compared with LPS group,#.P<0.05.

2.5APS對(duì)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的表面共刺激分子PD-L1 mRNA和蛋白表達(dá)變化的影響 結(jié)果顯示，LPS刺激BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞后，其表面PD-L1蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平略升高，用一定濃度的APS干預(yù)后，其表面PD-L1蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步升高，與對(duì)照組和LPS組相比，有顯著差異。研究結(jié)果如圖6。

3 討論

本研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中觀察了中藥黃芪對(duì)EAE 小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)，與未治療的EAE對(duì)照組相比較[10]，黃芪治療組小鼠EAE的發(fā)病起始及發(fā)病高峰時(shí)間均有所延遲，且發(fā)病高峰期癥狀評(píng)分明顯低于EAE組，表明黃芪對(duì)EAE 小鼠的臨床癥狀具有緩解作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了中藥黃芪對(duì)EAE具有肯定的治療效果。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)黃芪能減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，抑制MOG35-55特異性T 細(xì)胞增殖及IFN-γ、TNF-α、IL-17的分泌，促進(jìn)IL-4 的分泌。提示黃芪在EAE 發(fā)病過(guò)程中的治療通過(guò)抑制Th1 和Th17 細(xì)胞、促進(jìn)Th2 細(xì)胞功能而發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步揭示黃芪治療EAE的藥理機(jī)制[10]，本實(shí)驗(yàn)觀察了黃芪的有效成分APS對(duì)小鼠EAE臨床癥狀的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠明顯改善小鼠EAE的臨床癥狀評(píng)分，較黃芪改善作用更為明顯，提示APS對(duì)小鼠EAE具有肯定的治療作用。

在證實(shí)APS對(duì)EAE治療作用的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索了APS對(duì)小鼠EAE發(fā)揮治療作用的分子機(jī)制。近幾年來(lái)，隨著眾多學(xué)者對(duì)MS臨床和實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)在MS/EAE的病理過(guò)程中扮演重要角色，抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化以及抑制炎性因子的產(chǎn)生成為治療MS的新策略，因此，本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了APS對(duì)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用，并從PD-1/PD-L1信號(hào)通路探究了體外條件下APS對(duì)PD-L1蛋白及基因表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的APS可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ，抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，同時(shí)誘導(dǎo)PD-L1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。眾所周知，PD-1/PD-L1信號(hào)通路為負(fù)性調(diào)控信號(hào)，所以，APS誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)增加后，可以抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而抑制炎癥因子分泌及對(duì)髓鞘的損傷。

神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布在CNS，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)整個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的5%～20%，生理狀態(tài)時(shí)，神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息態(tài)，其表面非常多的細(xì)胞突起在不斷地伸縮從而探索周?chē)沫h(huán)境[13]，其主要作用是清除死亡的細(xì)胞以及軸突碎片，誘導(dǎo)神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以支持神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的正常功能，在神經(jīng)突起的發(fā)育中起引導(dǎo)作用，亦能促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生，增加髓鞘的形成，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管形成[14]。當(dāng)發(fā)生感染、損傷或神經(jīng)元電活動(dòng)紊亂等病理過(guò)程時(shí)，靜息態(tài)的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列形態(tài)、基因表達(dá)和功能方面的變化，導(dǎo)致神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[15]。活化后的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)病理過(guò)程中發(fā)揮雙刃劍的作用，一方面，神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后能夠分泌多種炎性介質(zhì)，如IL-6、IL-23、IL-1β和TNF-α、NO、氧自由基、蛋白水解酶等，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用[16]；另一方面，活化后的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)抗興奮毒、抗氧化酶、釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和抗炎因子及免疫吞噬等作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)再生[17，18]。

APS為中藥黃芪的主要活性成分，是黃芪中重要的天然有效成分，具有多重免疫活性，可體現(xiàn)在因劑量不同，作用不同方面，Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)低劑量的APS對(duì)小鼠的CD40、CD86有輕微抑制作用，而高劑量時(shí)則表現(xiàn)促進(jìn)作用,而大多數(shù)研究結(jié)果也顯示APS的作用效果在適當(dāng)范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系[20，21]。本研究的結(jié)果也呈現(xiàn)為低濃度APS抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，高濃度則減輕了對(duì)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用，劑量與功效有依存關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了APS能夠抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，提高活化后的細(xì)胞生存率，降低活化后BV-2細(xì)胞TNF-α、IFN-γ等炎性因子的分泌，以明確APS對(duì)EAE的治療作用和免疫機(jī)制。

PD-1/PD-Ls信號(hào)通路主要介導(dǎo)中樞和外周T細(xì)胞的免疫耐受和調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1信號(hào)通路在EAE的發(fā)病機(jī)制中具有明顯的調(diào)控作用[22]。PD-1/PD-L1作為負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，合理的增強(qiáng)或抑制其信號(hào)通路已被廣泛用于腫瘤免疫治療、病毒和微生物感染、器官移植和自身免疫性疾病等實(shí)驗(yàn)性治療，并且取得了良好的療效，美國(guó)已有公司研發(fā)出重組人類(lèi)PD-1、PD-L1 抗體，且已被FDA 批準(zhǔn)，主要用于某些腫瘤的治療[23]。本文發(fā)現(xiàn)，APS對(duì)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞PD-L1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)翻譯水平均具有明顯的上調(diào)作用，從而激活了PD-1/PD-L1分子信號(hào)的負(fù)調(diào)控作用，抑制了炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IFN-γ分泌，因此，抑制神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)，最終治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病。

3 結(jié)論

APS對(duì)小鼠EAE的臨床癥狀有明顯的抑制作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是由于APS上調(diào)了神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞PD-L1的基因和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制了神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少了炎性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌，這為臨床應(yīng)用APS治療MS等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供了新的思路和方法。

[1] Lovett-Racke AE.Contribution of EAE to understanding and treating multiple sclerosis[J].J Neuroimmunol,2017,304(5):40-42.

[2] Kurschus FC.T cell mediated pathogenesis in EAE:Molecular mechanisms[J].Biomed J,2015,38(3):183-193.

[3] Wlodarczyk A,Cédile O,Jensen KN,etal.Pathologic and protective roles for microglial subsets and bone marrow and blood-derived myeloid cells in central nervous system inflammation[J].Front Immunol,2015,8(6):463-463.

[4] Colonna M,Butovsky O.Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration[J].Annu Rev Immunol,2017,35(4):441-468.

[5] Sharpe AH,Wherry EJ,Ahmed R,etal.The function of programmed cell death 1and its ligands in regulating autoimmunity and infection[J].Nat Immunol,2007,3(8):239-245.

[6] Ishida Y,Agata Y,Shibahara K,etal.Induced expression of PD-1,a novel member of the immunoglobulin gene superfamily,upon programmed cell death[J].EMBO J,1992,11(11):3887-3895.

[7] 馬俊勇.鄭紹周教授治療多發(fā)性硬化經(jīng)驗(yàn)簡(jiǎn)介[J].四川中醫(yī),2008,26(11):5-6.

Ma JY.Professor Zheng Shaozhou′s experience in treatment of multiple sclerosis[J].J Sichuan Traditional Chin Med,2008,26(11):5-6.

[8] 孫林娟,寧 俠,周紹華.周紹華治療帕金森病經(jīng)驗(yàn)[J].中醫(yī)雜志,2015,56(3):193-194,197.

Sun LJ,Ning X,Zhou SH.ZHOU Shaohua′s Experience in Treating Parkinson′s Disease[J].J Traditional Chin Med,2015,56(3):193-194,197.

[9] 呂海兵.中醫(yī)藥分型論治老年癡呆癥療效觀察[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22(11):1209-1210.

Lv HB.Curative effect observation of TCM syndrome differentiation of alzheimer′s disease[J].Modern J Integrated Traditional Chin Western Med,2013,22(11):1209-1210.

[10] 孫 宇,王水英,黃夢(mèng)汶,等.黃芪對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠的治療作用及機(jī)制研究[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,27(4):56-62.

Sun Y,Wang SY,Huang MW,etal.Therapeutic effect and immunomodulatory mechanism of radix astragali seu hedysari on experimental autoimmune encephalomyelitis mouse[J].Acta Uni Traditionis Medicalis Sinensis Pharmacologiaeque Shanghai,2013,27(4):56-62.

[11] 安松蘭,張善玉,樸惠順.年生黃芪中黃芪多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(1):20-22.

An SL,Zhang SY,Piao HS.Effects of polysaccharides from the annual Astragalus on immuno-organs coefficients on mice[J].J Med Sci Yanbian Uni,2007,30(1):20-22.

[12] Stromnesk IM,Goverman JM.Active induction of experimental allergic encephalomyelitis[J].Nat Protocols,2006,1(4):1810-1819.

[13] Davalos D,Grutzendler J,Yang G,etal.ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo[J].Nat Neurosci,2005,8(6):752-758.

[14] Sasaki A.Microglia and brain macrophages:An update[J].Neuropathology,2017,37(5)：452-464.

[15] 李小媚,李?lèi)?ài)萍.小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和功能[J].解剖學(xué)研究,2010,32(3):213-217.

Li XM,Li AP.The development and function of microglial cells[J].Anatomy Res,2010,32(3):213-217.

[16] Prinz,M,Priller J.Microglia and brain macrophages in the molecular age:from origin to neuropsychiatric disease[J].Nat Rev Neurosci,2014,15(5):300-312.

[17] Yang X,Asakawa T,Han S,etal.Neuroserpin protects rat neurons and microglia-mediated inflammatory response against oxygen-glucose deprivation-and reoxygenation treatments in an in vitro study[J].Cell Physiol Biochem,2016,38(4):1472-1482.

[18] Schafer DP,Lehrman EK,Kautzman AG,etal.Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner[J].Neuron,2012,74(4):691-705.

[19] Zhang NW,Li JF,Hu YX,etal.Effects of astragalus polysaccharide on the immune response to foot-and-mouth disease vaccine in mice[J].Carbohydrate Polymers,2010,82(3):680-686.

[20] Zhang CL,Ren HJ,Liu MM,etal.Modulation of intestinal epithelial cell proliferation,migration and differentiation by astragalus polysaccharides on lipopolysaccharide-induced TNF-α and IL-1β[J].PLoS One,2014,9(8):e106674.

[21] He XJ,Shu J,Xu L,etal.Inhibitory effect of astragalus polysacc-harides on lipopolysaccharide-induced TNF-α and IL-1β production in THP-1 cells[J].Molecules,2012,17(3):3155-3164.

[22] Cheng X,Zhao Z,Ventura E,etal.The PD-1PD-L pathway is up-regulated during IL-12 induced suppression of EAE mediated by IFN-gamma[J].J Neuroimmunol,2007,185(1-2):75-86.

[23] Okazaki T,Honjo T.PD-1 and PD-1 ligands:from discovery to clinical application[J].Int Immunol,2007,19(7):813-824.