邢 楓 陶思羽 張 黎
(河南省人民醫(yī)院眼科/河南省立眼科醫(yī)院,鄭州 450003)
皮膚鱗狀細(xì)胞癌(Cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)簡稱皮膚鱗癌,是眼瞼部常見的皮膚惡性腫瘤之一,具有侵襲力高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)期預(yù)后差、耐藥性等特性,且發(fā)病率逐年增長[1]。遺傳因素及外部環(huán)境,細(xì)胞內(nèi)抑癌基因失活、癌基因突變、異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和凋亡過程等多種因素均可引起皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展,這提示該病的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多基因的復(fù)雜過程,因此,研究皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的分子機(jī)制對于診斷和治療具有重要意義。 BAG-1(Bcl-2-associated athanogene-1)是一種多功能蛋白,可與B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、多種生長因子受體等相互作用,抑制多種刺激因素誘導(dǎo)的凋亡,也可通過影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾-重組或降解,調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、黏附[2]。一些臨床研究發(fā)現(xiàn),在正常組織中BAG-1低表達(dá)或幾乎不表達(dá),而在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),如甲狀腺癌、乳腺癌等,影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等[3,4]。BAG-1基因在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的研究較少,有研究發(fā)現(xiàn),BAG-1基因在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中有高表達(dá),可降低化療敏感性[5],但關(guān)于其對皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖凋亡的影響及機(jī)制研究的尚不清楚。因此,本研究旨在探索BAG-1對皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖凋亡的影響,并進(jìn)一步探究可能的分子機(jī)制。
1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431購自中科院細(xì)胞庫;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、Trizol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Gibco公司;CCK8試劑盒購自美國Promega公司;二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;BAG-1、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Survivin抗體均購自美國SANTA CRUZ;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;實(shí)時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche;酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司;流式細(xì)胞儀均購自美國Bio-Rad公司。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞在RPMI1640高糖培養(yǎng)基中(含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml),置于37℃、飽和濕度及5%CO2培養(yǎng)箱中單層傳代培養(yǎng),每2~3 d更換一次培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)用生長至對數(shù)期的細(xì)胞。
1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以2×105個/孔將A431細(xì)胞鋪在不含血清的6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為空白組、陰性對照組和BAG-1-siRNA組。陰性對照組和BAG-1-siRNA組按照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染濃度為200 nmol/L。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞中的RNA、蛋白進(jìn)行檢測。
1.2.3轉(zhuǎn)染效果檢測 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染BAG-1的siRNA后A431細(xì)胞中BAG-1的mRNA表達(dá),簡要操作步驟如下:利用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA,紫外分光光度法定量,取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以GAPDH為內(nèi)參引物,實(shí)時熒光定量PCR對BAG-1進(jìn)行擴(kuò)增。相應(yīng)的引物序列如下:BAG-1 上游引物 5′-ACCCGTAGCAAGAACG-TGAC-3′,下游引物:5′-CACCAATTAACATGACT-CGGC-3′。GAPDH引物序列:上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min,94℃ 變性45 s、58℃ 退火45 s,72℃延伸45 s,循環(huán)35次,最后72℃延伸10 min。采集熒光值,根據(jù)Ct均值利用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì),以GAPDH作為內(nèi)參,分析BAG-1的mRNA相對表達(dá)量。
Western blot檢測轉(zhuǎn)染BAG-1的siRNA后A431細(xì)胞中BAG-1的蛋白表達(dá),簡要操作步驟如下:收集5×106個細(xì)胞,加入適量的裂解液裂解細(xì)胞,離心,取上清,BCA試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。取總蛋白60 μg,在15%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離,電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,硝酸纖維素膜用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h,加入1∶1 000稀釋的BAG-1、GAPDH一抗,4℃孵育,再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,洗膜,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影,自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。
1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 空白組、陰性對照組和BAG-1-siRNA組分別以1×105ml-1接種于96孔板,每孔中加入200 μl,于轉(zhuǎn)染后的48 h收集細(xì)胞,檢測時每孔中加入CCK8試劑10 μl,酶標(biāo)儀在570 nm處檢測三組細(xì)胞的吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/ml,取1 ml細(xì)胞,離心,棄掉上清,加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液振蕩懸浮細(xì)胞,再次離心,棄上清。加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入10 μl的AnnexinV-FITC和5 μl的PI,充分混勻后室溫避光反應(yīng)30 min,再加入300 μl結(jié)合緩沖液,1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
1.2.6IL-6、VEGF含量檢測 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后處理48 h,收集細(xì)胞上清,同時計(jì)數(shù)細(xì)胞,采用雙抗夾心ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清中IL-6、VEGF的含量。
1.2.7Bax、β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)檢測 參照1.2.3方法
2.1BAG-1-siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后BAG-1的表達(dá) BAG-1的siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞48 h后,RT-PCR及Western blot檢測BAG-1-siRNA組及陰性對照組和空白組細(xì)胞中BAG-1的表達(dá),結(jié)果顯示,陰性對照組BAG-1的mRNA及蛋白表達(dá)與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而在BAG-1-siRNA組的表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)。見圖1、表1。
2.2RNA干擾BAG-1表達(dá)對A431細(xì)胞增殖凋亡的影響 CCK8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,與空白對照組比較,BAG-1-siRNA組細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見圖2、表2。
圖1 BAG-1-siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后BAG-1的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of BAG-1 after BAG-1-siRNA was transfected into A431 cellsNote:1.Control group;2.NC-siRNA group;3.BAG-1-siRNA group.
表1BAG-1-siRNA轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞后BAG-1的mRNA及蛋白表達(dá)
Tab.1mRNAandproteinexpressionofBAG-1afterBAG-1-siRNAwastransfectedintoA431cells
GroupsmRNAexpressionofBAG?1ProteinexpressionofBAG?1Controlgroup1 000±0 0470 573±0 041NC?siRNAgroup1 011±0 0540 561±0 046BAG?1?siRNAgroup0 341±0 0311)0 234±0 0291)F217 70571 796P<0 01<0 01
Note:Compared with control group,1)P<0.05.
圖2 RNA干擾BAG-1表達(dá)對A431細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of BAG-1 expression by RNA interference on A431 cell apoptosis
2.3RNA干擾BAG-1表達(dá)對A431細(xì)胞 Bax、β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測a-2家族促凋亡蛋白 Bax及Wnt/β-catenin信號通路β-catenin、Survivin的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,與空白對照組比較,Bax蛋白表達(dá)顯著升高,β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。
2.4RNA干擾BAG-1表達(dá)對A431細(xì)胞 IL-6、VEGF含量的影響 通過ELISA試劑盒檢測RNA干擾BAG-1表達(dá)后A431細(xì)胞中IL-6、VEGF含量,結(jié)果如表4所示,BAG-1-siRNA組IL-6、VEGF含量均顯著低于空白組(P<0.05)。
表2RNA干擾BAG-1表達(dá)后A431細(xì)胞增殖凋亡情況
Tab.2EffectofBAG-1expressionbyRNAinterferenceonA431cellproliferationandapoptosis
GroupsODvalueApoptosisrate(%)Controlgroup0 416±0 0321 31±0 51NC?siRNAgroup0 402±0 0341 27±0 44BAG?1?siRNAgroup0 297±0 0261)9 12±0 911)F13 331143 494P<0 01<0 01
Note:Compared with control group,1)P<0.05.
圖3 RNA干擾BAG-1表達(dá)對A431細(xì)胞 Bax、β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of BAG-1 expression by RNA interference on expression of Bax,β-catenin and Survivin protein in A431 cellsNote:1.Control group;2.NC-siRNA group;3.BAG-1-siRNA group.
表3Bax、β-catenin、Survivin的蛋白相對表達(dá)量
Tab.3ProteinrelativeexpressionofBax,β-cateninandSurvivin
GroupsProteinrelativeexpressionBaxβ?cateninSurvivinControlgroup0 102±0 0090 553±0 0480 255±0 026NC?siRNAgroup0 094±0 0100 564±0 0520 271±0 028BAG?1?siRNAgroup0 642±0 0591)0 209±0 0221)0 108±0 0101)F242 47766 77446 571P<0 01<0 01<0 01
Note:Compared with control group,1)P<0.05.
表4RNA干擾BAG-1表達(dá)對A431細(xì)胞IL-6、VEGF含量的影響
Tab.4IL-6andVEGFcontentofA431cellsafterBAG-1expressionissuppressedbyRNAinterference
GroupsIL?6(pg/ml)VEGF(pg/ml)Controlgroup126 6±13 4377 7±29 6NC?siRNAgroup120 9±12 3372 3±26 4BAG?1?siRNAgroup75 8±8 51)291 5±17 81)F17 29310 199P<0 01<0 05
Note:Compared with control group,1)P<0.05.
RNA干擾是一種能使基因在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的機(jī)制,是目前公認(rèn)的快速有效的基因沉默技術(shù),能特異、高效地抑制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá),目前已在腫瘤治療、基因功能研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面得到廣泛應(yīng)用[6]。利用RNA干擾技術(shù)尋找更有效的皮膚鱗狀細(xì)胞癌治療方法具有重要意義。皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因、多階段的復(fù)雜過程,增殖、凋亡的失衡是其發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。因此,尋找在腫瘤中既能抑制細(xì)胞增殖,又能促進(jìn)凋亡的方法是治療的關(guān)鍵。BAG-1是一種多功能的抗凋亡蛋白,與細(xì)胞的增殖凋亡相關(guān)。BAG-1過度表達(dá)可使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)途徑激活受到抑制,從而抑制放射、化學(xué)試劑等誘導(dǎo)的凋亡[7]。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),BAG-1在多種腫瘤中有高表達(dá),其表達(dá)可作為結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤判斷預(yù)后的一個重要因素[8,9]。也有研究指出,通過RNA干擾技術(shù)沉默BAG-1的表達(dá)可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌放療敏感性,可能機(jī)制是抑制細(xì)胞增殖和促凋亡[10];在小鼠黑色素瘤生物學(xué)特性的研究中發(fā)現(xiàn),RNA干擾BAG-1表達(dá)后可明顯降低細(xì)胞增殖及克隆形成能力,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,并阻滯細(xì)胞于S期[11]。鑒于BAG-1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中研究較少,但已發(fā)現(xiàn)在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的高表達(dá),通過RNA干擾沉默其表達(dá),檢測細(xì)胞增殖凋亡情況,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖明顯受到抑制,且凋亡增加。
細(xì)胞凋亡受到復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控,胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡通路及Bcl-2、P53等均是這個系統(tǒng)的一部分。Bax是Bcl-2家族的成員之一,發(fā)揮促凋亡作用,其表達(dá)水平升高可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[12]。大量研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信號通路的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),在肝癌、胃癌等多種癌組織中均可檢測到Wnt信號分子及蛋白存在高表達(dá),而抑制其表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[13,14]。皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號通路可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[15]。β-catenin、Survivin是Wnt/β-catenin信號通路下游的靶基因,β-catenin、Survivin共同作用可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[16]。細(xì)胞因子對腫瘤具有殺傷和促生長的雙重作用,IL-6和VEGF是兩個促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞因子[17]。本研究中為了進(jìn)一步研究RNA干擾沉默BAG-1表達(dá)后引起細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制,及對細(xì)胞免疫的影響,通過Western blot檢測了Bax、β-catenin、Survivin蛋白表達(dá),通過ELISA試劑盒檢測了IL-6和VEGF含量,發(fā)現(xiàn)Bax蛋白表達(dá)上調(diào),β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)下調(diào),IL-6和VEGF含量降低。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾BAG-1表達(dá)可降低皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并可降低細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-6和VEGF的含量,其中影響細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)和抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。這些結(jié)果提示BAG-1可能是皮膚鱗狀細(xì)胞癌分子生物學(xué)診斷的指標(biāo),但本研究研究的還不夠全面。后續(xù)研究的重點(diǎn)是BAG-1對皮膚鱗狀細(xì)胞癌其他生物學(xué)特性的影響,以及在實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭醒芯科渥饔谩?/p>
[1] Wang A,Landén NX,Meisgen F,etal.MicroRNA-31 is overexpressed in cutaneous squamous cell carcinoma and regulates cell motility and colony formation ability of tumor cells[J].PLoS One,2014,9(7):e103206.
[2] Hung KW,Huang HW,Cho C C,etal.Nuclear magnetic resonance structure of the cytoplasmic tail of heparin binding EGF-like growth factor (proHB-EGF-CT) complexed with the ubiquitin homology domain of Bcl-2-associated athanogene 1 from Mus musculus (mBAG-1-UBH)[J].Biochemistry,2014,53(12):1935-1946.
[3] Ma F,Zhang M,Gong W,etal.MiR-138 Suppresses Cell Proliferation by Targeting Bag-1 in Gallbladder Carcinoma[J].PLos One,2015,10(5):e0126499.
[4] Emmanouil P,Natalia R,Alison Y,etal.A combination of trastuzumab and BAG-1 inhibition synergistically targets HER2 positive breast cancer cells:[J].Oncotarget,2016,7(14):18851-18864.
[5] Wood J,Pring M,Eveson JW,etal.Co-overexpression of Bag-1 and heat shock protein 70 in human epidermal squamous cell carcinoma:Bag-1-mediated resistance to 5-fluorouracil-induced apoptosis[J].Br J Cancer,2011,104(9):1459-1471.
[6] 劉志坤,祝淑釵,蘇景偉,等.RNA干擾MDC1基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞X線照后細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白表達(dá)影響[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志,2015,24(6):708-713.
Liu ZK,Zhu SC,Su JW,etal.Effect of RNA interference for MDC1 gene on cell cycle and expression of related proteins in esophageal carcinoma cells after X-ray radiation[J].Chin J Radiat Oncol,2015,24(6):708-713.
[7] Aveic S,Viola G,Accordi B,etal.Targeting BAG-1:A novel strategy to increase drug efficacy in acute myeloid leukemia[J].Exp Hematol,2015,43(3):180-190.e6.
[8] Huang W,Liu Z,Zhou G,etal.Magnetic gold nanoparticle-mediated small interference RNA silencing Bag-1 gene for colon cancer therapy[J].Oncol Reports,2016,35(2):978-984.
[9] Bruchmann A,Roller C,Walther T V,etal.Bcl-2 associated athanogene 5 (Bag5) is overexpressed in prostate cancer and inhibits ER-stress induced apoptosis[J].Bmc Cancer,2013,13(1):1-11.
[10] Yang L,Liu Z,minwen H,etal.Reduction of cisplatin resistance of lung cancer A549 cells through down-regula-ting the expression of BAG-1 mediated by shRNA[J].Chin J Cancer Biotherapy,2013,20(6):706-710.
[11] Enthammer M,Papadakis ES,Salomé GM,etal.Isolation of a novel thioflavin S-derived compound that inhibits BAG-1-mediated protein interactions and targets BRAF inhibitor-resistant cell lines[J].Mol Cancer Therapeutics,2013,12(11):2400-2414.
[12] 朵 杰,汪曉洲.芹菜素與老年大鼠缺血心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性[J].中國老年學(xué),2017,37(1):54-56.
Duo J,Wang XZ.Correlation of apigenin with apoptosis and expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in ischemic myocardium of old rats[J].Chin Gerontol,2017,37(1):54-56.
[13] Chen W,Zhang Y W,Li Y,etal.Constitutive expression of Wnt/β-catenin target genes promotes proliferation and invasion of liver cancer stem cells[J].Mol Med Reports,2016,13(4):3466-3474.
[14] 蘇 堅(jiān),趙曉紅,劉 芳,等.RORα高表達(dá)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路靶基因表達(dá)[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2016(11):1358-1365.
Su J,Zhao XH,Liu F,etal.Overexpression of RORα influence target genes of Wnt/β-catenin signaling pathway in human gastric MGC803 cells[J].Chin J Cell Biol,2016,38(11):1358-1365.
[15] Hui H,Wu N,Wu M,etal.Dihydroartemisinin suppresses growth of squamous cell carcinoma A431 cells by targeting the Wnt/β-catenin pathway[J].Anti-cancer Drugs,2016,27(2):99-105.
[16] Arend RC,Londono-Joshi AI,Samant RS,etal.Inhibition of Wnt/β-catenin pathway by niclosamide:a therapeutic target for ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2014,134(1):112-120.
[17] 王洪琰,王 郁,王佳麗,等.IL-6與VEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國腫瘤生物治療雜志,2015,22(5):619-624.0.
Wang HY,Wang Y,Wang JL,etal.Expression and clinical significance of IL-6 and VEGF in esophageal squamous cell cancer[J].Chin J Cancer Biotherapy,2015,22(5):619-624.