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        抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重組免疫毒素的表達和功能性檢測①

        2018-03-23 09:09:27紀洪帥郭錦瑞毛偉平
        中國免疫學(xué)雜志 2018年3期
        關(guān)鍵詞:單鏈毒素質(zhì)粒

        紀洪帥 郭錦瑞 楊 穎 毛偉平

        (江蘇省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室,南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210046)

        B7家族是尤為重要的共刺激分子,其中B7-H4分子是B7家族近年來發(fā)現(xiàn)的一個負性共刺激分子[1],它可以抑制T 細胞的應(yīng)答,在免疫抑制微環(huán)境中有著很大的作用。B7-H4的mRNA 普遍存在于人的各種組織和器官中,如腎臟、卵巢、肺、脾臟、胰腺等。但B7-H4蛋白在非淋巴正常組織中呈現(xiàn)出低表達或不表達,而在某些腫瘤組織中高表達[2]。Choi等[3]用免疫組化實驗來檢測各種組織中B7-H4蛋白的表達情況,結(jié)果表明,B7-H4蛋白在肺癌和卵巢癌中高表達,正常組織中則未檢測出 B7-H4 蛋白的表達。在其他腫瘤組織中也都檢測出了B7-H4 分子的異常高表達,這揭示了腫瘤細胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視可能與B7-H4分子有一定的關(guān)聯(lián)[4,5]。因此,可以將B7-H4分子作為腫瘤診斷及治療中一個潛在的靶標分子。

        靶向治療(Targeted therapy)是在細胞分子水平上,針對明確的致癌位點,來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物,該藥物在體內(nèi)能特異性結(jié)合致癌點并發(fā)生作用,使腫瘤細胞死亡,而不波及周圍的正常組織細胞。重組免疫毒素(Recombinant immunotoxins)就是腫瘤靶向治療的一種新方法,一般是將動植物或細菌來源的生物毒蛋白與抗體組合一起,定向攻擊腫瘤細胞,而對正常組織殺傷較小,被形象地稱為“生物導(dǎo)彈”[6]??贵w端負責(zé)與細胞表面或細胞因子受體結(jié)合,而毒素端負責(zé)引發(fā)細胞死亡[7]。由于靶向治療的特異性強,在殺傷腫瘤細胞時基本不損傷正常組織,所以抗腫瘤藥物的研發(fā)重點正在從傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)向靶向抗腫瘤藥物。如有研究者運用抗 HER2(人類表皮生長因子受體2)受體單鏈抗體與假單胞菌屬外毒素 ETA(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)連接構(gòu)造了免疫毒素,且在體外實驗表明該免疫毒素可以有效地抑制腫瘤細胞的增長[8]。本研究旨在建立以抗B7-H4單鏈抗體(Single chain antibody,scFv)為靶標的重組免疫毒素anti-B7-H4-scFv/PE38KDEL,利用單鏈抗體的靶向性和毒素分子的致毒性聯(lián)合起到殺傷腫瘤細胞的作用。

        1 材料與方法

        1.1實驗材料、試劑 pET28a(+)載體質(zhì)粒、克隆菌株大腸桿菌(Escherichia coli )DH5α、表達菌株大腸桿菌(Escherichia coli )BL21(DE3)、含有重組質(zhì)粒anti-B7-H4-scFv/pET43.1a 的DH5α、293a/T人腎上皮細胞、MCF-7 人乳腺癌細胞、A549 人肺癌細胞、HepG2 人肝癌細胞,均由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的江蘇省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室保存;T4 DNA 連接酶、DNA Marker、Phanta Max Super-Fidelity DNA polymeras、Taq DNA polymerase、pMD19-T Vector 購自南京諾唯贊生物公司;EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶和NotⅠ限制性內(nèi)切酶,購自日本TaKaRa公司;紫杉醇、抗 His 標簽抗體、HRP標記的羊抗鼠 IgG、Alexa Fluor 488-conjugated標記的IgG,購自中國上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司;PE38KDEL基因片段的合成、PCR 引物,合成于南京金凱瑞生物公司;SPF 級雌性BALB/c裸鼠,購自于南京大學(xué)模式動物中心;細胞培養(yǎng)6孔板和96孔板、HyClone、胎牛血清四季青、1 ml注射器、Biomiga 質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒,購自中國南京丁貝生物科技有限公司,其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2實驗方法

        1.2.1引物的合成 PE38KDEL基因是由南京金凱瑞公司合成,基因序列來自GenBank(version) K012397.1 GI:151215,進行大腸桿菌優(yōu)化后合成并亞克隆到pUC-57simple質(zhì)粒中,最后進行測序鑒定。引物P1為5′-AGATGCAGCCGGTGGCTCAGGC-GGTGGTAGCC-3′,下劃線是連接肽Linker(Gly3Ser)3,引物P2為5′-ATAAGAATGCGGCCGCCAGTTCA-TCTTTAGGC-3′,下劃線是NotⅠ的酶切位點;根據(jù)本實驗之前已獲得的抗B7-H4單鏈抗體的基因序列,合成的引物序列P3和P4,引物P3是5′-CGCGAATTCAAAGTGCAGCTGG-3′,下劃線是EcoRⅠ的酶切位點,P4是5′-GGCTACCACCGCCTGAGCCACCGGCTGCATCT-3′,下劃線是連接肽Linker。

        1.2.2目的基因的擴增和連接 利用PCR技術(shù),分別以實驗室含有anti-B7-H4-scFv/pET43.1a 重組質(zhì)粒的DH5α 菌液為模板和含有PE38KDEL基因的pUC-57質(zhì)粒的穿刺菌液為模板,擴增出anti-B7-H4-scFv基因和毒素PE38KDEL基因。PCR 擴增這兩段基因使用的體系和條件是一樣的,擴增anti-B7-H4-scFv基因所用的引物是P3和P4,擴增PE38KDEL基因所用的引物是P1和P2。50 μl PCR反應(yīng)體系:10×pfu Buffer with MgSO45 μl、dNTP Mix 2 mmol/L及引物P1、P2和模板各2 μl,雙蒸水補足至50 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃退火30 s,共30個循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后,將 PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠,進行割膠回收。利用SOE-PCR技術(shù)將PE38KDEL基因與anti-B7-H4-scFv這兩段基因連接。由于在引物設(shè)計時已考慮到后面SOE-PCR的特點,所以根據(jù)PE38KDEL基因與anti-B7-H4-scFv 這兩段基因所設(shè)計的的引物 P1和 P4 中各包含有一段重疊基因 Linker,首先讓PE38KDEL 與 anti-B7-H4-scFv 這兩段基因互為模板進行10次循環(huán)使兩段基因自連;然后向反應(yīng)體系中加入引物P2 和 P3,進行再次PCR 反應(yīng),反應(yīng)條件設(shè)置30次循環(huán),反應(yīng)其他條件則不變。PCR 反應(yīng)結(jié)束后,對目的條帶進行割膠回收。將回收的目的基因anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL與pUM19-T vector按照試劑盒進行T-A 克隆。之后進行菌落PCR鑒定,并根據(jù)菌落 PCR 的結(jié)果挑取陽性克隆的菌種樣品送至公司進行測序鑒定,測序結(jié)果正確的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3重組表達載體的構(gòu)建 取含有空載質(zhì)粒pET28a(+)的DH5α菌株50 μl涂于含有氨芐抗性(Amp+)的平板上,次日,挑取平板上長出的陽性克隆,于37℃、220 r/min的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),第二天根據(jù)Biomiga試劑盒提取pET28a(+)質(zhì)粒,測試質(zhì)粒濃度后,用 EcoRⅠ和 NotⅠ限制性內(nèi)切酶對 pET28a(+)質(zhì)粒和anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL 基因進行雙酶切。50 μl雙酶切體系:10 × Buffer H、BSA、Triton各5 μl,EcoRⅠ和NotⅠ各1 μl,1~2 μg pET28a(+)質(zhì)粒和anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL 基因分別10 μl,剩下雙蒸水補足。雙酶切條件:37℃ 水浴3 h。雙酶切后,將目的條帶割膠回收進行酶連反應(yīng)。酶連體系:10×T4 Buffer 2.5 μl,T4 DNA Ligase 1 μl,pET28a(+)質(zhì)粒和anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL 基因各4 μl。酶連條件:16℃ 水浴過夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中,步驟同TA克隆。經(jīng)測序正確后獲取一目的菌株。提取測序正確的重組菌株的質(zhì)粒pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。

        1.2.4重組毒素的表達、純化和檢測 將含有正確pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL重組載體質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌在37℃,220 r/min的條件下過夜培養(yǎng)。次日早上取40 μl 菌液轉(zhuǎn)接到4 ml含有卡納抗性(Kan+)的新鮮 LB 培養(yǎng)基中,在37℃,220 r/min震蕩培養(yǎng)3 h,使 OD 值約為0.6時,加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在IPTG不同的終濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L)及不同的誘導(dǎo)時間(2、4、6、8、10、12 h)下進行蛋白的誘導(dǎo)表達。收集表達菌液,離心棄上清,PBS重懸。將重懸的菌液進行超聲處理,跑 SDS-PAGE膠分析蛋白的表達情況,并找出最優(yōu)表達條件。在最佳誘導(dǎo)表達條件下擴大培養(yǎng)并收集上清和沉淀,將包涵體沉淀物進行變復(fù)性處理以獲得更多可溶性的上清,先用2 mol/L尿素變性液(2 mol/L Urea、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L imidazole)輕輕吹起包涵體,使溶液由渾濁至澄清,在高速冷凍離心機離心20 min,分別收集上清和沉淀。再分別用4 mol/L(4 mol/L Urea、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L imidazole)、6 mol/L(6 mol/L Urea、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L imidazole)尿素變性液輕輕吹起上步的包涵體剩余物,分別收集上清和沉淀。實驗所得的目的蛋白是將目的基因亞克隆到 pET28a(+)載體質(zhì)粒中,保留其帶His標簽的區(qū)域,所以其表達的產(chǎn)物帶有此標簽,而帶有His標簽的蛋白可與鎳柱結(jié)合,以此純化上清中的可融蛋白,然后用不同濃度的咪唑(20、50、100、200和300 mmol/L)洗脫蛋白并收集洗脫液,收集所有的洗脫液。把洗脫的蛋白液裝入煮過的透析袋中,并用含有8 mol/L尿素的復(fù)性液(20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L argnine、1 mol/L EDTA、1 mol/L GSH、1 mol/L MGSSG)做透析液,透析 36 h,每隔12 h更換一次透析液,最后用硝酸纖維素鈉將透析過后的蛋白進行濃縮,收集,進行Western blot 鑒定。

        1.2.5間接ELISA方法鑒定純化后的毒素和抗原的親和性 用抗原包被液將B7-H4抗原蛋白稀釋到終濃度5 μg/ml,100 μl/孔包被于96孔板,設(shè)置5個復(fù)孔,4℃過夜敷育。次日早上取出,先用100 μl/孔預(yù)冷的PBST隔10 min洗一次,洗3次。再用10% BSA封閉液于37℃敷育2 h,100 μl/孔。取出板子100 μl/孔預(yù)冷的PBST洗3次。每孔加入不同濃度的免疫毒素(100、10、1、0.1、0.01、0.001 μg/ml),同時設(shè)空白PBS組和對照組BSA組,100 μl/孔,37℃敷育1 h。取出板子用100 μl/孔預(yù)冷的PBST洗3次。每孔加入anti-His抗體100 μl,37℃敷育1 h。取出板子PBST洗3次。加HPR 標記的羊抗鼠 IgG 抗體,100 μl/孔,37℃敷育1 h。取出板子PBST洗3次,加 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液,100 μl/孔,37℃避光顯色20 min。取出板子每孔直接加入50 μl 終止液(2 mol/L H2SO4),終止反應(yīng)。終止反應(yīng)靜置5 min后,立即在酶標儀上測490 nm處的OD值。

        1.2.6流式細胞術(shù)檢測重組毒素與細胞的結(jié)合活性 采用間接熒光標記的方法,運用流式細胞術(shù)檢測免疫毒素對靶細胞的結(jié)合活性。復(fù)蘇實驗室凍存的人源乳腺癌細胞MCF-7、人源肝癌細胞HepG2、正常人腎皮細胞293a,用加了雙抗(鏈霉素和青霉素,終濃度都為100 U/ml)的10% 胎牛血清的 DMEM 新鮮培液培養(yǎng),細胞培養(yǎng)至對數(shù)期,用胰酶消化下來,以1×105/孔的密度接種于6孔板,過夜培養(yǎng);去培液,預(yù)冷的PBS輕輕洗滌4次;用5% BSA 4℃封閉1 h,PBS洗滌4次;加入復(fù)性的免疫毒素,輕輕吹打均勻,4℃孵育1 h,PBS洗滌4次;加入適當(dāng)稀釋(1∶5 000)的兔抗鼠抗His一抗,混吹均勻,4℃敷育1 h,PBS洗滌4次;加入適當(dāng)稀釋的Alexa Fluor 488-conjugated標記的熒光IgG,混勻,4℃避光敷育1 h ,PBS洗3次后重新用PBS重懸,流式細胞儀檢測。

        1.2.7MTT檢測細胞增殖 將MCF-7、HepG2、293T這3種細胞,在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞至對數(shù)期,稀釋計數(shù)后于1×104ml-1種于96孔板,每孔100 μl,培養(yǎng)過夜使細胞貼壁。用無菌PBS稀釋重組毒素,設(shè)5個濃度梯度(100、10、1、0.1、0.01 μg/ml),5個復(fù)孔,各加150 μl,陰性對照加同等量的無菌PBS,分別培養(yǎng)12、24、36、48 h,顯微鏡下觀察。每孔加20 μl的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng),去培液,各孔分別加150 μl DMSO,避光震蕩10 min,待晶體完全溶解后,于酶標儀讀數(shù)OD570 nm,計算細胞存活率。細胞存活率(%)=實驗組OD570 nm/對照組OD570 nm×100%。

        1.2.8腫瘤移植模型 培養(yǎng)人源肺癌細胞A549,待細胞生長狀態(tài)良好且長到實驗所要求數(shù)量時,處理細胞,最后用無血清的培養(yǎng)基重懸細胞并將細胞濃度調(diào)整為 1×107個/ml。選取的動物是20只SPF級雌性裸鼠,體重為16~18 g,周齡為4~6周。注射前輕輕彈動細胞懸液以防細胞貼壁,選擇裸鼠后腿根外側(cè)進針,用針頭輕挑起后腿根部皮膚,輕輕左右晃動看針頭是否刺入皮下,易擺動表示已進入皮下,緩慢注入細胞懸液,抽針時要快速并用棉球壓住針頭以防液體滲出。之后每天觀察小鼠生活狀態(tài)以及腫瘤生長狀況,待腫瘤體積生長至80~100 mm3左右時挑選生長狀態(tài)良好且腫瘤大小均一性較好的荷瘤鼠18只,隨機分成3組即空白對照組、陽性對照組和實驗組,開始隔天給藥??瞻捉M皮下注射 100 μl無菌生理鹽水,陽性對照組注射100 μl 5 mg/kg 紫杉醇,受試藥組皮下注射無菌過濾后的5 mg/kg重組毒素 anti-B7H4-scFv-PE38KDEL 100 μl。從給藥開始隔天用游標卡尺測量小鼠皮下腫瘤瘤徑并對小鼠體重作記錄。實驗結(jié)束,處死荷瘤鼠,手術(shù)剝?nèi)チ鰤K并稱重。

        1.2.9腫瘤組織HE染色及病理學(xué)形態(tài)觀察 從剝離下來的瘤塊中,各組隨機挑選3個進行 HE 染色分析。稱完瘤重后立即切取瘤塊,浸于4%多聚甲醛中固定 24 h。用自來水沖洗固定好的瘤塊。按照50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇 Ⅰ、95%乙醇 Ⅱ、100%乙醇 Ⅰ、100%乙醇 Ⅱ 的順序進行脫水,各浸泡2 h。脫水后的瘤塊于二甲苯中進行透明處理。將透明處理后的瘤塊浸于蠟中,隨后進行石蠟包埋。使用切片機切片,厚度為 5 μm,于 45℃ 溫水中燙平,貼于干凈載玻片上,45℃ 恒溫箱烘干。二甲苯進行脫蠟兩次,每次 5 min。按照無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水的順序進行復(fù)水,各浸泡5 min。蘇木素染色 5 min、清水清洗、1% 鹽酸酒精分化 5 min、1% 氨水浸泡1 min、清水沖洗、1%伊紅染色 2 min。按照75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇 Ⅱ、100%乙醇 Ⅰ、100%乙醇 Ⅱ 的順序進行脫水,各浸泡2 min。二甲苯Ⅰ浸泡5 min,二甲苯Ⅱ浸泡 5 min。用中性樹膠進行封片,然后在顯微鏡下進行觀察。

        1.2.10免疫組化分析 石蠟切片脫蠟至水。PBS清洗3次,每次5 min。加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液(甲醇80 ml+0.01 mol/L PBS 100 ml+30%H2O2)30 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響,PBS清洗3次,每次5 min。加入配好的0.3% Triton×100孵育30 min,以增加細胞的通透性,PBS清洗3次,每次5 min。加入稀釋的一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜,次日吸去抗體,PBS清洗3次,每次5min。加入稀釋的二抗,室溫孵育2 h,PBS清洗3次,每次5 min。加入ABC復(fù)合物之類的抗體,室溫孵育2 h,PBS清洗3次,每次5 min,自來水迅速沖3次。加入顯色液,進行免疫組織化學(xué)顯色,時間一般不超過30 min,可隨時在顯微鏡下進行觀察,待細胞著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液,用水迅速沖3次后加入PBS終止反應(yīng)。梯度酒精脫水之后,封片,拍照。

        2 結(jié)果

        2.1重組基因的擴增及鑒定 通過PCR技術(shù)分別擴增出的anti-B7-H4-scFv與 PE38KDEL兩段基因片段和SOE-PCR得到的重組基因anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,一起經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定分析,分別在750 bp與1 000 bp之間及在2 000 bp左右有清晰條帶(圖1),這與之前實驗中所得的研究結(jié)果和我們從NCBI中獲得的結(jié)果以及兩段相加所得是符合的。

        圖1 Anti-B7-H4-scFv基因、PE38KDEL基因和anti-B7-H4-scFv/PE38KDEL重組毒素基因Fig.1 Anti-B7-H4-scFv gene,PE38KDEL gene and recombinant toxin gene anti- B7-H4- scFv/PE-38KDELNote:Lane M.DL2000 DNA marker; Lane 1-3.PCR reaction products of gene anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL,PE38KDEL and anti-B7-H4-scFv.

        2.2重組表達載體的構(gòu)建、表達、純化及檢測 將構(gòu)建好的pET28a-anti-B7-H4-scFv/PE38KDEL重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定(圖2A),質(zhì)粒pET28a (+)大小為5 369 bp和目的基因anti-B7-H4-scFv/PE38 KDEL為1 788 bp,在Marker 5 000 bp和2 000 bp左右分別有一清晰亮帶。測序結(jié)果正確后,把含有正確pET28a-anti-B7-H4-scFv/PE38KDEL重組載體質(zhì)粒的BL21(DE3)大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后,得到了相對分子質(zhì)量(Mr)約70 kD左右的蛋白,并帶有His標簽。經(jīng) SDS-PAGE 分析,得出最優(yōu)表達條件時間是8 h、IPTG終濃度是0.6 mmol/L,且產(chǎn)物主要是以包涵體的形式存在,需要對包涵體沉淀進行變、復(fù)性處理以得到更多的可溶性蛋白。用一定濃度的尿素變性液洗滌、重懸沉淀包涵體后,收集變性后的上清液,將上清經(jīng)過鎳柱純化,并用不同濃度咪唑洗脫下來收集各洗脫液,進行跑膠鑒定(圖2B),50、100、150、250 mmol/L的洗脫結(jié)果沒有單一條帶,300 mmol/L的咪唑洗脫出單一蛋白條帶,并用Western blot鑒定純化產(chǎn)物。

        2.3間接ELISA鑒定重組毒素蛋白和抗原的親和性 實驗中以PBS作空白對照和BSA作陰性對照,兩者十分接近。B7-H4抗原蛋白作為實驗組,其結(jié)合程度隨著抗體蛋白濃度的遞減,吸光值變小,與空白PBS組相比差異顯著,P<0.05,見圖3。

        圖2 重組載體鑒定及目的蛋白洗脫純化情況Fig.2 Identification of recombinant vector and purific-ation of the target proteinNote:A.Lane M.DL15000 DNA marker;Lane 1-2.The results of recombinant plasmid after digestion.B.Lane M.Protein with a molecular weight of 100 kD marker;Lane 1.Escherichia coli BL21 (DE3) containing pET-28a (+) plasmid;Lane 2.pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL Escherichia coli BL21 (DE3) containing recombinant plasmid,supernatant inclusion body with IPTG final concentration of 0 mmol/L;Lane 3.pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL Escherichia coli BL21 (DE3) containing recombinant plasmid,supernatant of inclusion body with IPTG final concentration of 0.7 mmol/L;Lane 4-8.Eluent with 50,100,150,250 and 300 mmol/L imidazole;Lane 9.Results of purified immunotoxin by WB.

        2.4流式細胞術(shù)檢測重組毒素與細胞的結(jié)合活性 通過Western blot鑒定說明,重組毒素蛋白可以和三種細胞中的B7-H4蛋白結(jié)合,由于三種細胞中B7-H4蛋白的表達差異,所以結(jié)合有差異。分析結(jié)果如下(圖4),免疫毒素與293a、HepG2、MCF-7三種細胞的結(jié)合活性有差異,MCF-7細胞的結(jié)合活性比另外兩株細胞的結(jié)合活性高,說明毒素蛋白與靶細胞的結(jié)合是有特異性的。

        2.5MTT法檢測細胞增殖 為探究重組毒素蛋白對不同細胞株增殖的影響,選取B7-H4蛋白高表達、低表達和不表達的MCF-7、HepG2、293T三種細胞,以PBS作對照組,實驗組給予不同濃度(0.01、1.00、100 μg/ml)的除菌過濾的毒素蛋白,結(jié)果如圖5A所示,毒素蛋白對MCF-7、HepG2這兩種細胞的影響較大,且隨著濃度的增加,細胞的輪廓變模糊、形態(tài)變圓、細胞之間的黏附力變低,呈現(xiàn)出濃度依賴性。此外,MTT實驗在5個濃度梯度(0.01、0.1、1.00、10、100 μg/ml)對這3種細胞分別在12、24、36和48 h的條件下進行培養(yǎng),結(jié)果如圖5B所示,毒素蛋白對293T細胞的影響是蛋白濃度達到100 μg/ml,時間超過24 h時,細胞細胞存活率有所下降,但高于50%;對MCF-7、HepG2這兩種細胞的影響隨著濃度梯度的增加細胞存活率下降,并且作用時間持越長,細胞存活率越低,對MCF-7細胞的作用效果尤為明顯。

        圖3 間接ELISA親和分析Fig.3 Indirect ELISA affinity analysisNote: The data are mean+SEM(n= 5),compared with PBS group,*.P<0.05,**.P<0.01.

        圖4 流式結(jié)果分析Fig.4 Results of flow analysisNote:A.The blank control group 293a cells, the negative control group HepG2 cells and the experimental group MCF-7 cells B7-H4 protein and the internal reference protein were detected by WB;B.Blank control group 293a cells (No.1 line),negative control group HepG2 cells (No.2 line),experimental group MCF-7 cells (No.3 line) .

        圖5 重組毒素蛋白對MCF-7、HepG2、293T細胞增殖的影響Fig.5 Effect of recombinant toxin protein on MCF-7,HepG2,293T cells proliferation(±s,n=5)Note:A.Observations of cell morphology after MCF-7,HepG2 and 293 T cells were treated with PBS and 0.01,1.00,100 μg/ml,respectively;B.Cell survival was detected by MTT assay. 0.01,0.1,1.00,10 and 100 μg/ml toxin protein on MCF-7,HepG2 and 293T cells for 12,24,36 and 48 h,respectively.Compared with the control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

        圖6 荷瘤鼠體重和瘤體積變化及相對腫瘤增殖率Fig.6 Changes of body weight,tumor volume and relative tumor proliferation rateNote:A.Weight change of tumor-bearing mice after treatment with recombinant toxin protein,paclitaxel and saline for 15 days;B.The tumor volume growth changes after treatment;C.T/C(%) size of the positive drug group,the test group and the blank group.

        圖7 瘤塊大小比較及瘤重Fig.7 Comparison of tumor size and tumor weightNote:A.Morphology of three groups of tumor tissues in control group,test group and positive drug group;B.Comparison of tumor weight in the control group,the test group and positive drug group.Compared with the control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

        2.6荷瘤鼠體重和瘤體積變化 分組給藥后每天記錄荷瘤鼠的體重及腫瘤瘤徑。根據(jù)測量的結(jié)果計算出腫瘤體積(Tumor volume ,TV),計算公式為:TV=1/2×a×b2,其中a和b分別表示長和寬;并計算出相對瘤體積(Relative tumor volume,RTV),計算公式為:RTV=Vt/V0(其中V0為分籠給藥時測量所得瘤體積,Vt為每一次測量時的瘤體積)。根據(jù)計算出的相對瘤體積來計算出抗瘤活性的評價指標—相對腫瘤增殖率T/C(%),計算公式如下:

        TRTV:實驗組RTV ;CRTV:對照組RTV。

        生理鹽水、紫杉醇和重組毒素蛋白各治療15 d后,對荷瘤鼠體重和肺癌移植瘤生長體積的影響(圖6),陽性藥組即紫杉醇組荷瘤鼠體積變小最明顯,實驗組處于陽性藥組和空白組之間,說明重組毒素蛋白能抑制荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的生長,且實驗組的T/C(%)為38.2%(圖6)。

        GroupsThenumberofanimalsTumorweight(g)Tumorinhibitionrate(%)Blankcontrolgroup61 285±0 331-Positivecontrolgroup60 325±0 1432)74 71%Testgroup60 683±0 0861)46 89%

        Note:Compared with the control group,1)P<0.05,2)P<0.01.

        圖8 瘤組織HE染色結(jié)果(×200)Fig.8 HE staining results of tumor tissue(×200)Note:A.Blank control group tumor;B.Positive drug group tumor;C.Experimental group of tumors.

        圖9 免疫組化結(jié)果(×400)Fig.9 Immunohistochemical results(×400)Note:A.Blank control group tumor;B.Positive drug group tumor;C.Experimental group of tumors.

        表2免疫組化結(jié)果

        Tab.2Immunohistochemicalresults

        NameThenumberofpositivecellsThenumberoftotalcellPositiverate(%)Blankcontrolgroup53_400x010440PositivecontrolgroupP53_400x955110486 50TestgroupP53_400x689120857 03

        2.7瘤重 實驗結(jié)束時,處死荷瘤鼠,剝離出瘤組織,立即對瘤組織進行稱重,并根據(jù)公式計算腫瘤抑制率,公式:腫瘤抑制率(%)=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%(圖7和表1)。

        2.8瘤組織HE染色結(jié)果 瘤組織在多聚甲醇固定24 h后,進行包埋、切片和染色分析。對照組:腫瘤細胞生長活躍,間質(zhì)血管豐富,瘤細胞多呈圓形或橢圓形,大小不一,可見較多病理性核分裂象,如黑色箭頭所示(圖8A)。陽性藥組:腫瘤細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)同對照組,病理性核分裂象易見,如黑色箭頭所示;腫瘤組織中可見大面積壞死,壞死的腫瘤細胞核溶解,如紅色箭頭所示,或固縮深染,如黃色箭頭所示(圖8B)。實驗組:腫瘤細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)同對照組,病理性核分裂象易見,如黑色箭頭所示;腫瘤組織中可見局灶性壞死,壞死的腫瘤細胞核溶解或固縮深染,如紅色箭頭所示(圖8C)。

        2.9免疫組化分析 瘤組織進行免疫組化結(jié)果分析,見圖9和表2。

        3 討論

        免疫毒素是將具有細胞毒性的分子和導(dǎo)向能力的分子偶聯(lián)而成的具有特異性細胞殺傷力的雜合分子[9]。毒素之所以成為新的研究熱點是因為它和傳統(tǒng)的化療藥物的作用機制不同,腫瘤細胞對化療試劑產(chǎn)生自然耐藥或獲得性耐藥,而以毒素為基礎(chǔ)的治療方法卻不會產(chǎn)生交叉耐藥。因此,毒素對那些傳統(tǒng)化療耐受的細胞具有潛在的細胞毒性,這種特質(zhì)使其在癌癥治療中具有很大的吸引力[10]。如綠膿桿菌外毒素、白喉毒素和蓖麻肽類毒素等多肽類毒素通過化學(xué)或基因工程等方法已被連接到單克隆抗體上[11,12],用以構(gòu)建特異性的抗癌藥物。

        本研究中選擇的細菌來源的綠膿桿菌外毒素是參與構(gòu)建免疫毒素常用的毒素分子。PE是含613個氨基酸的單鏈蛋白,分子量為6.6×104,該蛋白有3個主要的結(jié)構(gòu)域,即DomainⅠa(1~252 aa),是細胞結(jié)合區(qū);Domain Ⅱ(253~364 aa),是膜轉(zhuǎn)位區(qū);DomainⅢ,ADP 核糖基化活性區(qū),抑制蛋白質(zhì)的合成。PE 的細胞毒作用機是:DomainⅠ區(qū)與細胞表面的受體結(jié)合,經(jīng)胞吞作用進入細胞,然后通過高爾基體運送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),再易位至胞漿。在那里,PE Domain Ⅲ能使肽鏈延長因子2(EF2)的ADP 核糖基化,不能與核蛋白體相互作用,肽鏈不能延長,從而阻礙蛋白質(zhì)的合成,導(dǎo)致真核細胞的死亡[13]。目前用于構(gòu)建重組免疫毒素的都是去除了細胞結(jié)合部位的PE 衍生物,如PE40、PE38 等。因為去除了細胞結(jié)合區(qū),它們喪失了非特異性細胞結(jié)合能力,但保留了轉(zhuǎn)位能力及細胞毒活性。另外,有研究表明,PE 羧基端的5個氨基酸殘基REDLK 經(jīng)缺失和突變改造成KDEL后PE的細胞毒性增強[14]。以PE類毒素為彈頭的免疫毒素種類很多,當(dāng)今以美國NIH腫瘤研究所構(gòu)建的HA22和SS1P最為經(jīng)典[15,16]。SS1P是PE毒素融合抗間皮素的抗體基因構(gòu)建的免疫毒素,I期臨床數(shù)據(jù)表明,SS1P已在多種間皮瘤有明顯的抗腫瘤作用[16]。

        選擇基于單克隆抗體為載體的免疫毒素居多,但單克隆抗體分子量大,致使最終的免疫毒素的分子量很大,組織滲透性差[6],而單鏈抗體是利用一段柔性連接肽將抗體的重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)連接形成的重組抗體蛋白[17]。現(xiàn)如今,較為常用的連接肽是一段反復(fù)出現(xiàn)的包含有4個甘氨酸(Gly)和1個絲氨酸(Ser),即(Gly4Ser)3形成的15肽序列[14,18]。由于單鏈抗體只有V區(qū),所以其免疫原性比較低;且分子質(zhì)量小,穿透力強,再連接上藥物或毒素,利用抗原和抗體的特異性結(jié)合對靶細胞進行特異性殺傷[19-21]。Xin等[22]用相關(guān)W7HY 片段修飾的脂質(zhì)體納米顆粒靶向給藥來治療胃癌。Saeed等[23]將免疫脂質(zhì)體與抗黑素瘤抗A1( medanoma antigen A1,MAGE A1) scFv結(jié)合在一起,靶向作用于黑素瘤細胞。陳昌友等[24]成功構(gòu)建了表達抗CD80-ScFv的細胞株,其分泌的抗體具有良好的生物學(xué)活性,為CD80及相關(guān)分子的基礎(chǔ)和臨床研究中提供重要的應(yīng)用價值。

        本研究成功構(gòu)建和表達了基于抗B7-H4的單鏈抗體的重組免疫毒素抗B7-H4-scFv/PE38KDEL,抗B7-H4單鏈抗體是從本實驗室已構(gòu)建好的抗B7-H4的單鏈抗體庫中篩選出的特異性較高的單鏈抗體[25],在此基礎(chǔ)上,連接上經(jīng)過改造修飾后的綠膿桿菌外毒素PE38KDEL。經(jīng)過表達條件優(yōu)化后,蛋白主要以包涵體的形式存在,之后經(jīng)過變復(fù)性純化,以得到更多的可溶性蛋白,但是復(fù)性效率的提高還需要進一步探索和研究。經(jīng)過變復(fù)性后的毒素蛋白分別對腫瘤細胞和荷瘤鼠模型進行活性驗證實驗。流式細胞分析技術(shù)說明毒素可以發(fā)揮其靶向性功能,與抗原高表達的癌細胞結(jié)合活性更高;MTT實驗表明了毒素蛋白可以抑制癌細胞的增殖活性;而腫瘤移植模型實驗與空白對照相比較而言,無論從荷瘤鼠體重變化、腫瘤體積變化和相對腫瘤增殖率,還是從腫瘤組織切片和免疫組化分析的這些指標,實驗組的毒素蛋白都可以展現(xiàn)出一定抑制腫瘤增殖的作用。但對毒素蛋白的給藥劑量上還需要繼續(xù)深入實驗研究,以找出最適的給藥量。總的結(jié)果來看,重組免疫毒素能夠一定程度抑制荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的生長。綜上所述,抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重組免疫毒素既能很好地結(jié)合陽性腫瘤細胞,發(fā)揮單抗的靶向作用,也能抑制腫瘤細胞的增殖,起到毒素的殺傷作用,這也為以后腫瘤靶向的研究探索和治療中提供了新的治療策略和新的思路。

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