劉 健 吳會芳 趙亞偉 張紀(jì)巖

(廣西醫(yī)科大學(xué),南寧 530021)

神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育相關(guān)受控表達(dá)分子8(Neural precursor cell-expressed developmentally down regulat-ed 8，NEDD8 )是一種類泛素化樣蛋白，與泛素最為接近[1,2]。NEDD8與底物蛋白共價(jià)結(jié)合的過程稱之為NEDD8共價(jià)修飾(Neddylation)，有著調(diào)節(jié)底物蛋白穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位和活性的作用。與泛素化修飾相同，NEDD8共價(jià)修飾需要酶1(Enzyme1，E1)、酶2(Enzyme2，E2)、酶3(Enzyme3，E3)的連續(xù)催化[3]，最終完成NEDD8分子與底物蛋白分子的共價(jià)結(jié)合。鑒定最清楚的NEDD8修飾底物是Cullins，Cullins是一類重要的泛素化修飾E3復(fù)合物中的關(guān)鍵組分，通過降解P-IκBα等機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖。MLN4924是一種小分子化合物，能夠特異性地與NEDD8活化酶E1結(jié)合，從而抑制NEDD8共價(jià)修飾的發(fā)生。大量研究報(bào)道揭示，NEDD8活化酶E1有希望成為抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)，而MLN4924作為NEDD8修飾的特異性抑制劑，可以抑制結(jié)腸癌、肺癌、多發(fā)性骨髓癌等多種腫瘤細(xì)胞的惡性生長[4-6]，有望成為新型抗腫瘤藥物。

近年來，我國卵巢癌的發(fā)病率正在逐年上升，且趨于年輕化，成為第二大危害女性健康的惡性腫瘤，是我國腫瘤治療的重點(diǎn)之一。目前，隨著我國醫(yī)療水平的提高，雖然很多患者的癥狀可以在早期就被發(fā)現(xiàn)并給予治療，使患者生存期大大延長，但依然存有很高的死亡率，嚴(yán)重威脅女性的身心健康。MLN4924對卵巢癌細(xì)胞惡性生長的影響及機(jī)制還不清楚，本文以不同濃度的MLN4924作用于人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，通過CCK-8法及Annexin V-APC/PI雙染等方法觀察其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制[7,8]，進(jìn)而為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 MLN4924，美國Active Biochen公司；胎牛血清，美國HyClone公司；AnnexinV-APC/PI試劑盒，美國BioLegend公司；RIPA裂解液、蛋白定量試劑盒，北京天根生物公司；山羊抗兔NEDD8抗體，英國Abcam公司；山羊抗兔P-IκBα和HER2抗體，美國Cell Signaling公司；山羊抗兔PAR3抗體，中國愛必信公司；山羊抗鼠β-actin抗體，美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗，北京中杉金橋公司；CCK-8試劑盒，碧云天公司；ECL和人IL-6 ELISA試劑盒，美國Thermo公司；X光片、顯影液、定影液，美國Kodak公司。

1.1.2儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱、低溫高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；酶標(biāo)儀，瑞士Tecan sunrise公司；紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。SDS-PAGE蛋白電泳及轉(zhuǎn)印，美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，本實(shí)驗(yàn)室保種存放。由含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度生長至80%左右，0.25%胰酶消化、計(jì)數(shù)、傳代。1.2.2CCK8法檢測細(xì)胞存活 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，以每孔5×103細(xì)胞接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁后，分別加入MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L處理72 h，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。72 h后，每孔直接加入1/10體積的Cell Counting Kit 8(CCK8)，充分混合，保證孔中藍(lán)色均一性，但避免產(chǎn)生氣泡。于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h至顏色變?yōu)槌壬?，在酶?biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度(A450 nm)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-藥物組A450 nm/對照組A450 nm)×100%。

1.2.3Western蛋白印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 使用不同濃度MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L處理24孔板內(nèi)生長良好的SKOV3細(xì)胞4 h后，用預(yù)冷的PBS 1 ml/孔洗滌細(xì)胞一次，每孔加80 μl RIPA裂解液，用細(xì)胞刮在冰上迅速刮下，吸取裂解液至預(yù)冷的1.5 ml EP管中，冰上裂解15 min，再4℃離心機(jī)，13 000 r/min離心15 min，吸取上清至新的預(yù)冷1.5 ml EP管中，利用蛋白定量試劑盒調(diào)整蛋白濃度一致。加入4×SDS上樣緩沖液，100℃沸水煮10 min，6 000 r/min離心30 s，彈勻。SDS-PAGE電泳，60 V恒壓轉(zhuǎn)印3 h冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h后，加入一抗(PAR3、HER2、NEDD8、P-IκBα、β-Actin)4℃過夜，次日TBST洗滌10 min×3遍后加二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌10 min×3遍后，于暗室加入ECL發(fā)光顯影。

1.2.4ELISA法測定IL-6的表達(dá)情況 將生長良好的SKOV3細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔5×104細(xì)胞接種于24孔板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁，分別加入MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L處理4 h，每組設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，4 h時(shí)取培養(yǎng)基上清，按照ELISA試劑盒說明操作檢測，在酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度，測定其OD A450 nm值，使用prism軟件計(jì)算分析。

1.2.5流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 處理方法同上述1.2.4，培養(yǎng)72 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌兩遍棄上清，70%乙醇4℃固定過夜，與RNaseA在37℃下共培養(yǎng)30 min后用PI避光染色10～15 min后，立即用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 處理方法同上述1.2.4，培養(yǎng)72 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌一遍棄上清，Annexin V Buffer洗滌并重懸，按照試劑盒說明分別加入Annexin V-APC/PI抗體，避光染色15 min后，立即用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1MLN4924對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用 MLN4924在0.125、0.25和0.5 μmol/L的濃度下對SKOV3細(xì)胞作用72 h時(shí)，對細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且隨著劑量的加大，抑制效果也顯著提高，在0.125、0.25和0.5 μmol/L的濃度下，細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到了5%、32%和41%，見圖1。

2.2MLN4924通過誘導(dǎo)P-IκBα積聚抑制IL-6表達(dá) 已有研究表明，自分泌的IL-6促進(jìn)HER2陽性腫瘤細(xì)胞惡性生長，而NF-κB、PAR3和HER2是這些細(xì)胞中調(diào)控IL-6表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制[9-12]。分別加入MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L處理SKOV3細(xì)胞4 h后，0.25和0.5 μmol/L組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6分泌下降(圖2)。同樣條件下，將細(xì)胞裂解，Western blot檢測PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)P-IκBα隨MLN4924劑量的升高而積聚，NEDD8共價(jià)修飾的Cullins蛋白量明顯降低，而PAR3、HER2表達(dá)水平變化不顯著(圖3)。提示MLN4924誘導(dǎo)P-IκBα積聚，IκBα降解減少，NF-κB入核減少，導(dǎo)致IL-6表達(dá)下降。

2.3MLN4924對SKOV3細(xì)胞周期的影響 由圖4和表1可以看出，SKOV3細(xì)胞經(jīng)不同濃度MLN4924刺激72 h后，加藥組S期細(xì)胞百分比相較于對照組明顯升高，表明MLN4924誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯，且MLN4924 劑量在0.25和0.5 μmol/L時(shí)，可以看到形成了大量的四倍體細(xì)胞，使之沒有完整的細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖。

圖1 MLN4924對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of MLN4924 on proliferation of SKOV3 cells(±s，n=4)Note:Compared with control (0 μmol/L) group,*.P<0.05，**.P<0.01.

圖2 MLN4924對SKOV3細(xì)胞分泌IL-6的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of MLN4924 on secretion of IL-6 by SKOV3 cells

圖3 MLN4924對SKOV3細(xì)胞PAR3、P-IκBα、neddylated-cullins、HER2表達(dá)的影響Fig.3 Effect of MLN4924 on PAR3,P-IκBα，neddylated-cullins，HER2 expression in SKOV3 cellsNote:Lanes 1-5.MLN4924 0，0.125，0.25,0.5，1 μmol/L，respectively.

圖4 MLN4924對SKOV3細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of MLN4924 on cell cycle of SKOV3 cellsNote:A-D.MLN4924 0,0.125,0.25 or 0.5 μmol/L treatment for 72 h,respectively.

MLN4924(μmol/L)Diploid%G0+G1/%S/%G2+M/%Tetraploid%G0+G1/%S/%G2+M/%Apoptosis/%010071 14±0 2 18 88±0 49 98±0 402 78±0 30 125100037 91±1 31) 29 05±0 61)33 04±0 74 20±0 90 2534 92±0 365 08±0 31)30 94±2 51) 61 06±2 51)8±0 164 2±0 0524 31±0 611 49±0 6 6 23±0 51)0 5 6 2±2 5 93 8±2 51)19 9±9 91) 72 1±9 91)8±0 139 55±1 3 44 93±1 615 52±0 4 30 90±0 81)

Note：Compared with control (0 μmol/L) group，1)P<0.01.

圖5 MLN4924對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of MLN4924 on apoptosis of SKOV3 cellsNote:A-D.MLN4924 0,0.125,0.25 or 0.5 μmol/L treatment for 72 h,respectively.

2.4MLN4924對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響 用濃度為0、0.125、0.25和0.5 μmol/L的MLN4924處理SKOV3細(xì)胞72 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，加藥組與對照組相比較發(fā)現(xiàn)，隨著MLN4924濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也明顯提升，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明MLN4924能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖(表1、圖5)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，MLN4924在體外對SKOV3細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。SKOV3細(xì)胞是HER2陽性腫瘤細(xì)胞，這類細(xì)胞的惡性生長往往依賴于IL-6的自分泌，而NF-κB，PAR3和HER2是調(diào)控IL-6表達(dá)分泌的關(guān)鍵機(jī)制[9-12]。為了研究MLN4924對卵巢癌細(xì)胞增殖抑制的作用機(jī)制，我們用Western blot檢測了PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表達(dá)，同時(shí)檢測IL-6的分泌情況。我們的結(jié)果提示MLN4924處理導(dǎo)致P-IκBα積聚，IκBα降解減少，NF-κB入核減少，所以導(dǎo)致了IL-6表達(dá)下降[13,14]。

細(xì)胞的增殖依賴于細(xì)胞周期的運(yùn)行，而腫瘤治療的中心環(huán)節(jié)就是干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而使腫瘤細(xì)胞增殖速率減慢或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞走向死亡。我們還分析了不同濃度MLN4924處理后，MLN4924對SKOV3細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡影響的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MLN4924誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯，且MLN4924劑量在0.25和0.5 μmol/L時(shí)，形成了大量的四倍體細(xì)胞，使之沒有完整的細(xì)胞周期，同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯升高，從而抑制細(xì)胞增殖[15]。

P-IκBα積聚、IL-6自分泌的下降可以部分解釋MLN4924對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡效應(yīng)。但是細(xì)胞S期阻滯，特別是大量的四倍體細(xì)胞的形成，無法用這一機(jī)制來解釋。顯然，MLN4924利用多種機(jī)制抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性生長。

總之，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平闡述了MLN4924對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制作用，為其用于卵巢癌的臨床治療提供了一定的理論依據(jù)，下一步將從具體的分子機(jī)制、與現(xiàn)有化療藥物之間的協(xié)同效應(yīng)等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步評價(jià)MLN4924對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用及其安全性。

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