張錦鵬 張冠文 宣國云 張 歡 姜東伯 楊 琨

(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部免疫學(xué)教研室，西安 710032)

漢坦病毒(Hantavirus，HTV)屬于布尼亞病毒科布尼亞病毒屬的一類有包膜分節(jié)段單股負(fù)性RNA病毒[1]。主要通過接觸嚙齒類動(dòng)物的呼吸道分泌物傳播，導(dǎo)致兩種自然疫源性疾?。悍謩e為腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(Hantavirus cardiopulm-onary syndrome,HCPS)[2]。HFRS是以發(fā)熱、出血、急性腎功能損傷為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，亦稱流行性出血熱[3]。我國是世界上HFRS發(fā)病最為嚴(yán)重的國家，占總發(fā)病人數(shù)的90%以上，嚴(yán)重威脅我國居民的生命健康與安全[4]。基因疫苗因能夠模擬病原體自然感染激活體內(nèi)免疫應(yīng)答，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸方面具有優(yōu)勢而成為疫苗研制領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。

漢灘病毒基因組分為大(L)、中(M)、小(S)三個(gè)片段，分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣殼蛋白(NP)[5]。其中M片段全長僅有一個(gè)開放閱讀框編碼包膜糖蛋白復(fù)合體，該前體蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被切割加工成Gn與Gc兩個(gè)糖蛋白。Gn與Gc構(gòu)成病毒吸附蛋白，可識(shí)別結(jié)合細(xì)胞表面病毒受體，在病毒對(duì)機(jī)體細(xì)胞的侵襲與感染過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。同時(shí)，Gn和Gc可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，刺激機(jī)體生成一定量保護(hù)性的中和抗體。中和抗體在清除體內(nèi)病毒這一過程中有重要作用，提示漢坦病毒的Gn與Gc在建立機(jī)體對(duì)抗病毒感染發(fā)病的特異性免疫保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[8-10]，有望成為DNA疫苗研究的靶點(diǎn)。

溶酶體相關(guān)膜蛋白(Lysosome-associated membr-ane protein，LAMP)是位于溶酶體膜上的Ⅰ型穿膜蛋白，由N端溶酶體內(nèi)腔部分、疏水穿膜部分及C末端短胞漿尾構(gòu)成。LAMP分子合成后，其保守的短胞漿尾通過穿膜-胞漿區(qū)定向結(jié)合亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)——內(nèi)吞體/溶酶體，主要發(fā)揮靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的重要功能[11]。當(dāng)目的基因插入到LAMP分子編碼溶酶體內(nèi)腔部分和胞漿尾的基因之間表達(dá)出嵌合蛋白，利用LAMP分子胞漿尾靶向至內(nèi)體/溶酶體膜作用，可將LAMP融合蛋白中目的抗原直接攜帶進(jìn)入主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子器室(MHC class Ⅱ compartment，MⅡC)，從而可實(shí)現(xiàn)DNA疫苗所表達(dá)蛋白從內(nèi)源性抗原的MHCⅠ類加工途徑向外源性抗原的MHCⅡ類加工提呈途徑的轉(zhuǎn)化[12]。

1 材料與方法

1.1材料 重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。DNA測序委托生工生物技術(shù)(上海)有限公司完成。去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根生物有限公司140只SPF級(jí)6周齡雌性BALB/c小鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(軍)2012-0007]。漢坦inactivated病毒為本實(shí)驗(yàn)室保存，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為本實(shí)驗(yàn)室研制。MicroReader酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)

1.2方法

1.2.1重組載體的構(gòu)建及鑒定 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定參考文獻(xiàn)[13,14]。并且轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示目的基因能夠在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)[13,14]。

1.2.2重組基因疫苗的免疫方案 140只6周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠分7組(pVAX組、pVAX-LAMP組、pVAX-Gn組、pVAX-LAMP/Gn組、pVAX-Gc組、pVAX-LAMP/Gc組和inactivated疫苗組)，每組20只。按50 μl/只(質(zhì)粒濃度均為1 mg/ml，inactivated疫苗按照1∶5稀釋)經(jīng)尾根部皮下免疫，共免疫3次每次間隔3周(圖1)(注：按照滅活疫苗的使用要求，只進(jìn)行2次免疫)。初次免疫前需采集正常小鼠血清，以后每次免疫后2周尾靜脈取血，分離免疫血清，低溫下保存用于抗體檢測。

1.2.3間接ELISA法檢測特異性抗體 用inactivated的病毒包被96孔ELISA板，4℃過夜。次日洗板并加入系列稀釋的小鼠免疫血清，100 μl/孔，37℃孵育1 h，PBST洗滌4次后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100 μl/孔，37℃孵育1 h后，PBST洗滌4次，TMB顯色10～30 min，ELISA板置于酶標(biāo)儀測定OD450 nm值。

1.2.4中和試驗(yàn) 將免疫鼠血清用MEM培養(yǎng)液1∶5稀釋，以0.22 μm濾膜過濾除菌，然后作系列倍比稀釋，分別與100倍TCID50的HTNV混合，37℃孵育90 min，依次加于單層Vero E6細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度血清設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照組，細(xì)胞對(duì)照組和陽性mAb A3D8對(duì)照組。37℃、5%CO2繼續(xù)孵育90 min后，吸棄培養(yǎng)液，換入含2%血清的MEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，感染9～11 d后收集培養(yǎng)細(xì)胞并凍融3次，夾心ELISA法檢測細(xì)胞中感染的病毒：mAb 1A8或SP2/0(1∶1 000)包被ELISA板，4℃過夜，洗滌3次后，加入細(xì)胞凍融液100 μl/孔，37℃孵育1 h，洗滌后加入HRP-1A8 mAb，37℃孵育1 h，洗滌后OPD顯色10～30 min，2 mol/L H2SO4中止反應(yīng)，測OD490nm值。

1.2.5攻毒實(shí)驗(yàn) 在第60天，各組小鼠注射76～118病毒株(105pfu/只)，3 d后處死小鼠，夾心ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測攻毒后體內(nèi)各組織特異性抗原NP病毒載量(VL)評(píng)價(jià)體內(nèi)保護(hù)效力。所有實(shí)驗(yàn)均在BSL-3條件下，并基于國際實(shí)驗(yàn)室的生物安全手冊(cè)。

圖1 小鼠免疫策略Fig.1 Strategy of mice immunizationNote:BALB/c mice were immuned every three weeks for three times.Blood was taken from caudal vein two weeks after every immunization.

圖2 ELISA檢測特異性抗體Fig.2 ELISA were used to dectect specific antibodyNote:The specific humoral responses elicited against Hantavirus Gc were measured by detecting specific antibody.Results showed that titer of specific antibodies in serum of each group got higher in the wake of immunization times. The pVAX-LAMP group had the highest antibodies efficacy reaching to 1∶2 500,followed by pVAX-Gc and pVAX-LAMP/Gn.Compared to pVAX and pVAX-L1AMP group,pVAX-Gn and Inactived vaccine group were negative in antibodies.

圖3 中和抗體檢測Fig.3 Neutralizing antibody detectionNote:pVAX-LAMP/Gc group had the highest neutralizing antibody efficacy.Chimeric DNA vaccine groups all significantly had higher efficacy than Inactived vaccine group.

圖4 免疫后小鼠注射病毒通過ELISA和q-PCR檢測重要臟器的病毒載量Fig.4 ELISA and q-PCR were used to detect viral load after virus challengingNote:To measure the protective efficacy,virus challenging in vivo and were conducted by viral load detection after prophylactic immunization.Except pVAX and pVAX-LAMP,other groups of mice were negative in Hantaan virus-specific antigen,which suggests chimeric DNA vaccine can protect mice viscera from Hantaan virus.

2 結(jié)果

2.1免疫血清中的特異性抗體 結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，各組小鼠血清中特異性抗體滴度逐漸升高。pVAX-LAMP/Gc組的抗體效價(jià)最高，3次免疫后達(dá)到1∶2 500，其次是pVAX-Gc組和pVAX-LAMP/Gn組，均明顯優(yōu)于Inactived vaccine組，然而pVAX-Gn組與 Inactived vaccine組抗體效價(jià)未見明顯差異。對(duì)照pVAX組和pVAX-LAMP組未有抗體檢出(圖2)。

2.2中和抗體 pVAX-LAMP/Gc組小鼠血清中和抗體效價(jià)最高，依次為pVAX-Gc組、pVAX-LAMP/Gn組和pVAX-Gn組，抗體效價(jià)均明顯優(yōu)于Inactived vaccine組(圖3)。

2.3攻毒實(shí)驗(yàn) 除pVAX、pVAX-LAMP兩組外，其余組小鼠體內(nèi)未檢出漢坦病毒特異性抗原，表明小鼠重要臟器可在重組疫苗的保護(hù)下免受病毒感染(圖4)。

3 結(jié)論

目前我國臨床上用于防治HFRS的疫苗的是雙價(jià)inactivated疫苗[15]，可以產(chǎn)生具有保護(hù)活性的中和抗體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較為有效的體液免疫。然而，該疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答及產(chǎn)生長期免疫記憶能力方面存在不足，大大降低了它在公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域中的推廣價(jià)值[16]?，F(xiàn)傳統(tǒng)DNA疫苗表達(dá)的內(nèi)源性抗原，主要通過MHCⅠ類抗原加工提呈途徑活化CD8+T細(xì)胞，因此很難有效活化CD4+T細(xì)胞[17]。但活化CD4+T細(xì)胞能夠分泌大量細(xì)胞因子，在刺激其他免疫細(xì)胞活化、增殖、分化以及促進(jìn)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中，發(fā)揮著重要的作用。此外CD40L由活化的CD4+T細(xì)胞表達(dá)，是作為活化B細(xì)胞必不可少的第二信號(hào)，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生，分泌抗體，發(fā)揮機(jī)體的體液免疫[18]。

LAMP分子是溶酶體膜上的主要成分，當(dāng)其由LAMP基因合成后，其保守的短胞漿尾通過穿膜-胞漿區(qū)定向地結(jié)合亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)——內(nèi)吞體/溶酶體，發(fā)揮靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的重要功能[11]。本實(shí)驗(yàn)利用LAMP這一特性，將編碼目的抗原的基因插入到編碼LAMP分子的序列中，利用LAMP分子，將HTNV包膜糖蛋白(Gn和Gc)直接攜帶進(jìn)入MⅡC，實(shí)現(xiàn)一種新的轉(zhuǎn)換MHC抗原加工提呈的途徑，有效地激活了CD4+T細(xì)胞[12]?；罨腃D4+T可以分泌大量細(xì)胞因子，刺激其他的免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化[19]，又能表達(dá)CD40L，作為第二信號(hào)輔助B細(xì)胞活化從而分泌特異性抗體，有效提高了DNA疫苗的免疫效率[20]。

前期曾有文獻(xiàn)報(bào)道以漢坦病毒M全長為目的基因研制基因疫苗，并發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生一定滴度的中和抗體。但M全長較長，與LAMP分子(1 200 bp)重組后會(huì)有目的蛋白過大表達(dá)量低的問題。并且根據(jù)病毒M基因在表達(dá)前體蛋白后會(huì)在WAASA序列處切割為Gn和Gc兩個(gè)糖基化蛋白[21，22]。因此，本次研究分別以Gn和Gc為目的基因通過分子克隆手段，利用HTNV糖蛋白cDNA成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pVAX-LAMP/Gn、pVAX-LAMP/Gc。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一方面，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建HTNV包膜糖蛋白(Gn和Gc)嵌合溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP的重組質(zhì)粒載體，并且證明其可在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。在免疫評(píng)價(jià)中，漢坦病毒包膜糖蛋白Gn和Gc均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。說明Gn和Gc有很好的免疫原性，均可作為HFRS的DNA疫苗良好的靶點(diǎn)。LAMP組在誘導(dǎo)抗體上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)DNA疫苗，可見LAMP分子策略在基因疫苗研制方面獨(dú)有的優(yōu)越性，有著良好的臨床應(yīng)用前景[23]。該研究為后續(xù)新型漢坦病毒基因疫苗的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] Mir MA.Hantaviruses[J].Clin Lab Med,2010,30(1):67-91.

[2] Avsic-Zupanc T,Saksida A，Korva M.Hantavirus infections[J].Clin Microbiol Infect,2016:doi:org/10.111/1469-0691.12291.

[3] Jiang H,Du H,Wang LM,etal.Hemorrhagic fever with renal syndrome:pathogenesis and clinical picture[J].Front Cell Infect Microbiol,2016,6(1):1.

[4] Jiang H,Zheng X,Wang L,etal.Hantavirus infection:a global zoonotic challenge[J].Virol Sin,2017,32(1):32-43.

[5] Battisti AJ,Chu YK,Chipman PR,etal.Structural studies of Hantaan virus[J].J Virol,2011,85(2):835-841.

[6] Cifuentes-Munoz N,Salazar-Quiroz N，Tischler ND.Hantavirus Gn and Gc envelope glycoproteins:key structural units for virus cell entry and virus assembly[J].Viruses,2014,6(4):1801-1822.

[7] Muyangwa M,Martynova EV,Khaiboullina SF,etal.Hantaviral proteins:structure,functions,and role in hantavirus infection[J].Front Microbiol,2015,6:1326.

[8] Hooper JW and Li D.Vaccines against hantaviruses[J].Curr Top Microbiol Immunol,2001,256:171-191.

[9] Boudreau EF,Josleyn M,Ullman D,etal.A phase 1 clinical trial of Hantaan virus and Puumala virus M-segment DNA vaccines for hemorrhagic fever with renal syndrome[J].Vaccine,2012,30(11):1951-1958.

[10] Hooper JW,Moon JE,Paolino KM,etal.A phase 1 clinical trial of Hantaan virus and Puumala virus M-segment DNA vaccines for haemorrhagic fever with renal syndrome delivered by intramuscular electroporation[J].Clin Microbiol Infect,2014,20(Suppl 5):110-117.

[11] Anwar A,Chandrasekaran A,Ng ML,etal.West Nile premembrane-envelope genetic vaccine encoded as a chimera containing the transmembrane and cytoplasmic domains of a lysosome-associated membrane protein:increased cellular concentration of the transgene product,targeting to the MHC II compartment,and enhanced neutralizing antibody response[J].Virology,2005,332(1):66-77.

[12] Yang K,Sun K,Srinivasan KN,etal.Immune responses to T-cell epitopes of SARS CoV-N protein are enhanced by N immunization with a chimera of lysosome-associated membrane protein[J].Gene Ther,2009,16(11):1353-1362.

[13] Jiang DB,Sun LJ,Cheng LF,etal.Recombinant DNA vaccine of Hantavirus Gn and LAMP1 induced long-term immune protection in mice[J].Antiviral Res,2017,138:32-39.

[14] Jiang DB,Sun YJ,Cheng LF,etal.Construction and evaluation of DNA vaccine encoding Hantavirus glycoprotein N-ter minal fused with lysosome-associated membrane protein[J].Vaccine,2015,33(29):3367-3376.

[15] Szabo R.Antiviral therapy and prevention against hantavirus infections[J].Acta Virol,2017,61(1):3-12.

[16] Song JY,Woo HJ,Cheong HJ,etal.Long-term immunogenicity and safety of inactivated Hantaan virus vaccine (Hantavax) in healthy adults[J].Vaccine,2016,34(10):1289-1295.

[17] Nuchtern JG,Biddison WE，Klausner RD.Class Ⅱ MHC molecules can use the endogenous pathway of antigen presentation[J].Nature,1990,343(6253):74-76.

[18] Marques ET Jr,Chikhlikar P,de Arruda LB,etal.HIV-1 p55Gag encoded in the lysosome-associated membrane protein-1 as a DNA plasmid vaccine chimera is highly expressed,traffics to the major histocompatibility class II compartment,and elicits enhanced immune responses[J].J Biol Chem,2003,278(39):37926-37936.

[19] Nakanishi Y,Lu B,Gerard C,etal.CD8(+) T lymphocyte mobilization to virus-infected tissue requires CD4(+) T-cell help[J].Nature,2009,462(7272):510-513.

[20] Chikhlikar P,Barros de Arruda L,Maciel M,etal.DNA encoding an HIV-1 Gag/human lysosome-associated membrane protein-1 chimera elicits a broad cellular and humoral immune response in Rhesus macaques[J].PLoS One,2006,1:e135.

[21] Ganaie SS,Mir MA.The role of viral genomic RNA and nucleocapsid protein in the autophagic clearance of hantavirus glycoprotein Gn[J].Virus Res,2014,187:72-76.

[22] Hussein IT,Cheng E,Ganaie SS,etal.Autophagic clearance of Sin Nombre hantavirus glycoprotein Gn promotes virus replication in cells[J].J Virol,2012,86(14):7520-7529.

[23] Dhalia R,Maciel M Jr,Cruz FS,etal.Membrane and envelope virus proteins co-expressed as lysosome associated membrane protein (LAMP) fused antigens:a potential tool to develop DNA vaccines against flaviviruses[J].An Acad Bras Cienc,2009,81(4):663-669.