卜繼常 鄒 燕 聶 倩 雷文波 周 洲 陸春雪 陳超群 李忠玉

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所/特殊病原體防控湖南省重點實驗室，衡陽 421001)

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)感染具有較廣泛的致病譜，能引起沙眼，泌尿生殖道感染和性病淋巴肉芽腫等疾病，是導(dǎo)致失明及性傳播疾病的最常見病因[1]。由于Ct感染病程隱匿，常不易被發(fā)現(xiàn)而延緩治療轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥径T發(fā)一系列嚴重并發(fā)癥，因此闡明Ct致病機制以尋找合適的診斷和治療方法成為迫在眉睫的任務(wù)。

衣原體嚴格細胞內(nèi)寄生，抑制細胞凋亡、逃避宿主細胞免疫清除以維持自身的細胞內(nèi)生長發(fā)育是衣原體重要的致病機制之一[2,3]。細胞凋亡機制主要有線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部途徑及死亡受體介導(dǎo)的外部途徑。Bcl-2家族在調(diào)控線粒體途徑中發(fā)揮重要作用，該家族成員包括了抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xL和促凋亡蛋白Bad、Bax和Bak等[4]。Bax和Bak等蛋白能增加線粒體膜通透性釋放細胞色素c，激活下游一系列激酶，最終活化關(guān)鍵效應(yīng)激酶Caspase 3誘導(dǎo)細胞凋亡，而Bcl-2蛋白能拮抗Bax/Bak的激活抑制宿主細胞凋亡[5]。有研究表明衣原體可通過多種分子機制抑制Bax的表達、增加Bcl-2的表達來抑制宿主細胞凋亡[2]。但其具體機制還需要進一步研究。

除了含有高度保守的基因組外，Ct還含有一個大小為7.5 kb的隱蔽性質(zhì)粒，質(zhì)粒基因編碼8個質(zhì)粒蛋白，其中pORF5是唯一一種表達之后分布于宿主細胞胞漿的分泌性蛋白[6]。前期研究已經(jīng)證實，pORF5蛋白能介導(dǎo)Ct炎癥反應(yīng)，并參與Ct免疫病理過程[7-10]，提示pORF5蛋白在Ct致病過程中發(fā)揮重要作用。為進一步探討pORF5質(zhì)粒蛋白對細胞凋亡的影響及其分子機制，本研究用不同濃度的pORF5質(zhì)粒蛋白以不同時間刺激HeLa細胞，并應(yīng)用信號通路抑制劑特異性阻斷PI3K/Akt通路，通過對細胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2的表達水平的檢測，綜合分析pORF5質(zhì)粒蛋白抗細胞凋亡效應(yīng)及機制。本研究為深入探討pORF5質(zhì)粒蛋白在Ct的致病機制中的作用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；兔抗Bax、Bcl-2、p-Akt、t-Akt抗體等為CST公司產(chǎn)品；鼠GAPDH抗體為Proteintech公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品；蛋白分子量標準為Invitrogen公司產(chǎn)品；谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B、PreScission蛋白酶為Pharmacia 公司產(chǎn)品；HeLa細胞、XL1-Blue大腸桿菌、pGEX-6p和pGEX-6p/pORF5原核表達載體為本研究所保存。

1.2方法

1.2.1pORF5融合蛋白的表達與純化 將已構(gòu)建好的pGEX-6p/pORF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL1-Blue大腸桿菌，IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h后，低速離心收菌，加入細菌裂解液并超聲破菌，高速離心收集上清并加入谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B純化GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白經(jīng)Prescission 蛋白酶切除GST標簽得到pORF5蛋白。pORF5蛋白經(jīng)多粘菌素B去內(nèi)毒素處理后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細胞培養(yǎng)和蛋白刺激 將HeLa細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用不同濃度(0、5、10、15、25 μg/ml)的pORF5蛋白與20 ng/ml的TNF-α共刺激HeLa細胞0、8、12、24 h，部分實驗根據(jù)需要用PI3K/Akt抑制劑LY294002預(yù)處理HeLa細胞30 min，再用15 μg/ml的pORF5質(zhì)粒蛋白以不同的時間刺激HeLa細胞。

1.2.3細胞凋亡率的檢測 HeLa細胞經(jīng)上述方法處理后，分成2組，第一組分別用4%的多聚甲醛固定10 min、0.1%TritonX-100處理5 min后，PBS洗滌后再加入Hoechst 33258染色30 min，最后用PBS洗滌、封片，干燥，熒光顯微鏡下觀察。第二組用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌后，1× Binding Buffer緩沖液調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/ml，加入AnnexinV/PE和7-AAD，單染細胞組分別加入AnnexinV/PE或7-AAD，空白對照組不加入任何染料，輕輕混勻并避光孵育15 min。2 h內(nèi)流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.4Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白和PI3K/Akt磷酸化水平 收集處理后的細胞標本，PBS洗滌后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液充分裂解細胞，離心后去上清并加入2×SDS上樣緩沖液，加熱煮沸10 min后，取適量進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別加入兔抗Bax、Bcl-2、磷酸化的Akt、總Akt和鼠抗GAPDH抗體，4℃孵育過夜后，0.05%的TBST洗3次，加入HRP標記的羊抗兔或抗鼠抗體，最后加ECL底物顯色，曝光顯影觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析各組實驗數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，當P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GST-pORF5融合蛋白的酶切與鑒定 pGEX-6p-1/pORF5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B純化后，再用PreScission蛋白酶切割GST標簽后可見約28 kD的pORF5蛋白(圖1A)。進一步用Western blot鑒定切割GST標簽后的pORF5質(zhì)粒蛋白，結(jié)果可見分別在54和28 kD處有清晰的條帶，與預(yù)期分子相符(圖1B)。

2.2pORF5蛋白對HeLa細胞凋亡的抑制作用 HeLa細胞血清饑餓24 h后，再分別用pORF5蛋白、TNF-α處理24 h，Hoechst 33342染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理組和空白對照組中HeLa細胞核出現(xiàn)核固縮、核碎裂，高亮藍色凋亡小體；pORF5處理組大部分HeLa細胞核呈現(xiàn)均勻淡藍色，核固縮現(xiàn)象明顯減少(圖2A)。AnnexinV/PE和7-AAD染色后，流式細胞技術(shù)檢測HeLa細胞的凋亡情況，圖2B中Q2區(qū)表示晚期凋亡的細胞；Q3區(qū)表示早期凋亡的細胞；Q1區(qū)表示壞死的細胞，故取Q2+Q3計算凋亡率。結(jié)果顯示三組細胞的凋亡率分別是(31.2±4.2)%、 (12.3±1.8)%和(3.9±1.1)%， pORF5處理組細胞凋亡率較TNF-α處理組約降低27.3%(P<0.01)，相比于空白對照組約降低8.4%(圖2C，P<0.05)。

圖1 GST-pORF5融合蛋白酶切后產(chǎn)物SDS-PAGE分析及Western blot鑒定Fig.1 Analysis of digested products of GST-pORF5 fusion protein by SDS-PAGE and Western blotNote:A.SDS-PAGE analysis of digested products of GST-pORF5 fusion protein;1.Protein marker;2.Supernatant after the first wash from beads;3.Supernatant after the second wash from beads;4.Supernatant after the third wash from beads;5.Supernatant after the fourth wash from beads.B.Western blot analysis of digested products of GST-pORF5 fusion protein;1.E.coli;2.Supernatant after digestion of GST-pORF5 fusion protein.

圖2 pORF5蛋白對HeLa細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of pORF5 protein on apoptosis of HeLa cellsNote:A.Morphological observation of apoptotic cells by Hoechst staining;B.Effect of pORF5 protein on apoptosis of HeLa cells by flow cytometry.

圖4 PI3K/AKT信號通路對pORF5介導(dǎo)細胞抗凋亡的影響Fig.4 Effects of PI3K/AKT signal pathway on anti-apoptosis mediated by pORF5 proteinNote:A.Effect of pORF5 protein on PI3K/Akt signal pathway;B.Effects of PI3K/Akt signal pathway on the expression of Bax and Bcl-2 mediated by pORF5 protein;C.Effects of PI3K/Akt signal pathway on apoptosis mediated by pORF5 protein.*.P<0.01.

圖3 pORF5蛋白對Bcl-2和Bax表達水平的影響Fig.3 Effect of pORF5 protein on expression of Bcl-2 and BaxNote:A.Effect on expression of Bcl-2 and Bax at different concentration of pORF5 protein;B.Effect of pORF5 protein on expression of Bcl-2 and Bax at different time.

2.3pORF5蛋白對Bcl-2和Bax表達水平的影響 用不同濃度的pORF5蛋白刺激HeLa細胞24 h，Western blot分析Bax和Bcl-2的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pORF5蛋白刺激濃度為5～15 μg/ml時，Bax的表達隨pORF5蛋白濃度的升高而逐漸減少，而Bcl-2蛋白的表達水平隨pORF5蛋白濃度的升高而逐漸增加，當pORF5濃度達15 μg/ml時，Bax和Bcl-2蛋白表達變化最明顯(圖3A)。用最佳pORF5蛋白刺激濃度(15 μg/ml)以不同時間處理Hela細胞，發(fā)現(xiàn)Hela細胞在刺激8 h后Bax和Bcl-2蛋白的表達水平發(fā)生變化；當刺激時間達24 h時，Bax和Bcl-2的蛋白表達變化最明顯(圖3B)。

2.4PI3K/Akt信號通路參與pORF5介導(dǎo)的抗細胞凋亡作用 pORF5蛋白以不同時間(0、5、15、30、60 min)刺激HeLa細胞后，Western blot分析Akt的磷酸化水平。結(jié)果由圖4A可見，Akt在15 min發(fā)生磷酸化，30 min磷酸化水平最高。當HeLa細胞用20 μmol/L的PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002預(yù)處理1 h后，再以pORF5蛋白刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LY294002能明顯抑制Akt磷酸化水平，并顯著提高Bax的表達水平，降低Bcl-2的表達水平(圖4B)；LY294002預(yù)處理組凋亡細胞數(shù)明顯增加，細胞凋亡率較對照組增加了13.0%(P<0.01)。

3 討論

抑制宿主細胞凋亡從而完成自身的生長發(fā)育是Ct重要的免疫逃逸機制之一[2,3]。Ct抗凋亡機制與抑制凋亡前體蛋白Bax表達，降解促凋亡BH3-only蛋白，上調(diào)凋亡抑制因子，阻止細胞色素c從線粒體釋放等機制有關(guān)[11]。在凋亡信號分子刺激下，Bax/Bak與線粒體上的電壓依賴性離子通道發(fā)生相互作用促進線粒體細胞色素c的釋放，最終導(dǎo)致細胞凋亡，而Bcl-2蛋白能拮抗Bax/Bak的激活從而抑制宿主細胞凋亡[5]。為研究Ct質(zhì)粒蛋白pORF5與細胞凋亡的關(guān)系，本研究用pORF5蛋白刺激HeLa細胞后發(fā)現(xiàn)，pORF5蛋白刺激組多數(shù)細胞的細胞核正常，呈現(xiàn)均勻的藍色熒光，而凋亡誘導(dǎo)劑TNF-α處理組和空白對照組較多細胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂，致密的亮藍色凋亡小體；pORF5刺激組凋亡率相比于TNF-α陽性對照組降低27.3%，相比于未刺激組降低8.5%。進一步分析pORF5蛋白對凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl-2的表達水平影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當pORF5濃度達10 μg/ml時，Bax表達下調(diào)，Bcl-2表達上調(diào)，并在濃度達到15 μg/ml時變化最明顯，15 μg/ml的pORF5蛋白刺激HeLa細胞24 h，Bax和Bcl-2的表達變化最明顯，說明pORF5通過降低Bax，增加Bcl-2的表達水平抑制宿主細胞凋亡。

PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)是一種具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，可催化膜表面的二磷酸磷脂肌醇(PIP2)磷酸化形成三磷酸磷脂肌醇(PIP3)，后者與磷酸肌醇依賴性激酶(PDK1)結(jié)合，使Akt磷酸化后激活。Akt激活后能調(diào)節(jié)下游多種信號途徑，是參與細胞增殖、分化、凋亡調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并與癌細胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成相關(guān)[12-14]。有研究表明，在Ct可通過PI3K/Akt信號通路穩(wěn)定抗凋亡蛋白Mcl-1，使Bad磷酸化并與14-3-3β 和IncG結(jié)合，阻止細胞色素c的釋放抑制宿主細胞凋亡[15]。為分析PI3K/Akt信號通路是否介導(dǎo)了pORF5質(zhì)粒蛋白的抗凋亡過程，并進一步研究其效應(yīng)機制，本實驗測定了pORF5刺激HeLa細胞后Akt的磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt在pORF5刺激HeLa細胞30 min后發(fā)生明顯的磷酸化；使用PI3K特異性抑制劑阻斷PI3K/Akt信號通路后，發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化水平降低，Bax表達水平上調(diào)，而Bcl-2的表達水平下調(diào)；Hoechst 及流式細胞儀檢測結(jié)果均發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑處理后細胞凋亡率增加，證實了PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)pORF5蛋白的抗凋亡活性。

綜上，本研究應(yīng)用原核表達系統(tǒng)表達并純化pORF5質(zhì)粒蛋白，pORF5質(zhì)粒蛋白體外刺激HeLa

細胞，發(fā)現(xiàn)pORF5能通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，下調(diào)促凋亡蛋白Bax抑制細胞凋亡；進一步應(yīng)用特異性抑制劑抑制PI3K/Akt信號通路，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號通路后，細胞凋亡率較對照組顯著增加，并可增加Bax蛋白的表達、降低Bcl-2的表達，初步證實了pORF5蛋白通過激活PI3K/Akt信號通路抑制細胞凋亡。本研究為闡明pORF5在Ct致病機制中的作用提供了實驗依據(jù)。

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