李 迎, 杜小燕, 崔曉霞, 馬蘭芝, 尚世臣,趙志兵, 趙 權(quán), 李桂軍, 王冬平, 陳振文

(1. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心, 北京 100071;2. 首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部, 北京 100069;3. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長春 130118)

在臨床上血栓與止血檢測已被廣泛應(yīng)用，血栓與出血不僅涉及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué), 且與多個臨床學(xué)科(包括血液科、呼吸消化科、心血管科神經(jīng)科)的疾病密切相關(guān)。凝血酶原時間(PT)、部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)和凝血酶時間(TT)是臨床診斷出血和血栓性疾病的常規(guī)檢測項目，也是抗凝血藥物用量監(jiān)測，療效評估和手術(shù)前預(yù)測凝血功能的重要指標(biāo)[1]。凝血4項指標(biāo)檢測在內(nèi)源性、外源性凝血因子缺乏或減少的實驗中是重要依據(jù)。在相關(guān)醫(yī)學(xué)實驗研究中，常常要觀測實驗動物的上述4項指標(biāo)。本文針對腦缺血模型近交系CMU/1與CMU/2長爪沙鼠和常用近交系F344大鼠及BALB/c小鼠的4項凝血指標(biāo)進(jìn)行測定與比較，旨在了解腦缺血模型近交系長爪沙鼠的特性，為其實驗研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

CMU/1 長爪沙鼠36只, CMU/2長爪沙鼠12只,均為3～4月齡，普通級，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供; 50只近交系F344大鼠，40只近交系BALB/c小鼠，均為清潔級，由軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心提供[SCXK(軍)2012-0004]。實驗動物自由采食和飲水，室溫為20～24 ℃。本實驗通過首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物和動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(No. AEEI-2017-032)。

1.2 儀器設(shè)備及主要試劑

MC-4000四通道血凝儀,由德國美創(chuàng)公司生產(chǎn)，配套試劑由上海太陽生物技術(shù)有限公司提供;質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%的檸檬酸鈉抗凝劑，由北京雷根生物技術(shù)有限公司提供; 低溫離心機(jī)(CF16RX)，日本Hitachi公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集和處理 實驗前動物禁食12～24 h，自由飲水。眼眶靜脈取血900 μL, 置于含100 μL抗凝劑試管，即血液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%檸檬酸鈉溶液以9∶1的比例充分顛倒混勻, 7 000 r/min離心15 min制備血漿。

1.3.2 樣品檢測及指標(biāo) 將用蒸餾水復(fù)溶的試劑和待測標(biāo)本置于預(yù)熱槽至37 ℃。PT檢測: 于37℃孵育60 s, 然后加入預(yù)溫的100 μL試劑; APTT檢測:準(zhǔn)備50 μL血漿與50 μL APTT試劑，預(yù)溫180 s，之后加入50 μL CaCl2試劑; FIB檢測: 準(zhǔn)備10 μL血漿和90 μL IBS試劑，預(yù)溫后加入50 μL FIB試劑;TT檢測: 準(zhǔn)備100 μL血漿，加入50 μL預(yù)溫好的TT試劑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理, 使用單因素方差分析對測得的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

CMU/1的PT、FIB與F344大鼠差異顯著，APTT與BALB/c小鼠和F344大鼠差異顯著; CMU/2的PT、ATPP與F344大鼠差異顯著; F344大鼠的PT、APTT與BALB/c小鼠差異顯著; CMU/1和CMU/2彼此間差異不顯著(表1)。CMU/1的APTT、FIB和CMU/2的FIB個體間差異較大。

表 1 各組動物4項凝血指標(biāo)Table 1 Four blood coagulation factors of animals in each group

3 討論

血液凝固是由一系列凝血因子按一定順序相繼激活酶解而生成凝血酶，最終使FIB變?yōu)槔w維蛋白的過程。一般分為外源性凝血途徑、內(nèi)源性凝血途徑和凝血共同途徑。目前，臨床主要用凝血4項(PT、APTT、TT、FIB)測定來反映體內(nèi)凝血系統(tǒng)的狀況。

PT主要用于檢測外源性凝血系統(tǒng)有無障礙，是監(jiān)測口服抗凝劑的首選指標(biāo)。PT延長常見于先天性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ缺乏癥，PT縮短見于先天性凝血因子Ⅴ增多，血栓性疾病等。APTT是用于檢測內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較為敏感和常用的篩選試驗，能反映血漿凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的水平; 也可用于相關(guān)因子抑制物的測定和肝素治療的監(jiān)測，其準(zhǔn)確性測定即可取得最佳抗凝療效，又無嚴(yán)重的出血風(fēng)險[2]。FIB用于纖溶的篩查[3]，通過凝血酶的作用使FIB轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。主要由肝臟合成，是凝血酶作用的底物，在凝血酶水解下形成肽A和肽B，最后形成不溶性的纖維蛋白以達(dá)到止血作用。TT主要代表血漿纖維蛋白原的反應(yīng)性，用于測定凝血共同途徑纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的過程中，是否存在纖維蛋白原異常及是否發(fā)生纖溶和是否存在抗凝物質(zhì)的情況[4,5]。

通過對上述動物4項凝血指標(biāo)的測定可以看出,實驗動物的品種不同，指標(biāo)間差異較大。PT值和APTT值CMU/1、CMU/2以及BALB/c小鼠都與F344大鼠差異顯著，CMU/1與BALB/c小鼠的APTT值差異顯著，F(xiàn)IB值CMU/1與F344大鼠差異顯著。王迎等[6]報道的SD大鼠、Wistar大鼠、ICR小鼠及長爪沙鼠4項凝血因子指標(biāo)測定結(jié)果顯示, 不同品種實驗動物的同一指標(biāo)間差異較大，這與本實驗的結(jié)論是一致的。但是CMU/1、CMU/2和BALB/c小鼠的TT值顯示+++，表明該測定方法不在線性范圍內(nèi)，未測出結(jié)果。是否與離心轉(zhuǎn)速、測試比例等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步探討研究。紅細(xì)胞沉淀不徹底會干擾血漿的測定, 標(biāo)本離心不好，血小板去除不徹底都會影響測定結(jié)果。

實驗結(jié)果還會受到動物狀態(tài)、樣品采集后放置時間及處理、抗凝劑與試劑、設(shè)備、儀器等多方面因素的影響[7-10]。因此在實際工作中，應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程進(jìn)行操作，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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