賈 杰, 代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心、云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 云南省眼科疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì), 昆明 650118)

白內(nèi)障(Cataract)作為世界范圍內(nèi)主要的致盲性眼科疾病，是一種由遺傳和環(huán)境等因素引起的以晶狀體渾濁為特征的眼科疾病[1]。據(jù)報道[2]全球視力受損者約為2.85億人, 視力低下者2.46億人，失明0.39億人。其中33%的視力受損和51%的失明是由白內(nèi)障引起。影響晶狀體透明性的因素眾多, 且白內(nèi)障存在高度的異質(zhì)性，臨床上根據(jù)發(fā)病年齡、病因、晶狀體渾濁形態(tài)和程度分為先天性白內(nèi)障、創(chuàng)傷性白內(nèi)障和代謝性白內(nèi)障等[3]。目前研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的主要手段之一是構(gòu)建動物模型，構(gòu)建白內(nèi)障模型常用的動物有大鼠、小鼠、豚鼠。不同類型的白內(nèi)障動物模型可復(fù)制各種白內(nèi)障發(fā)病的病因或臨床癥狀，解決患者眼部材料不易獲取的難題。因此，建立穩(wěn)定的白內(nèi)障動物模型是眼科臨床醫(yī)學(xué)研究十分重要的內(nèi)容之一。本文就國內(nèi)外關(guān)于白內(nèi)障動物模型建立和相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 先天性白內(nèi)障

先天性白內(nèi)障是由染色體變異或基因突變等原因引起，該類型白內(nèi)障動物模型可通過物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)基因突變所建立。Jochen等[4]采用乙基亞硝基脲(ethylnitrosourea, ENU)法對小鼠誘變篩選, 結(jié)果顯示Cryba1基因第6外顯子的第2堿基可由T突變?yōu)锳，且雜合突變表現(xiàn)為胎兒眼睛晶狀體表層乳濁化，而純合突變則完全發(fā)展為白內(nèi)障，認(rèn)為該突變類型的小鼠可作為研究人類先天性繞核性白內(nèi)障很好的動物模型。另外，先天性白內(nèi)障動物模型也可以用群體中偶發(fā)先天性白內(nèi)障的動物，經(jīng)側(cè)交、回交等繁殖手段保持其遺傳特性。Bu等[5]利用昆明近交系小鼠建立隱性白內(nèi)障的小鼠模型，研究顯示Crygs基因外顯子3第489位堿基可由G突變?yōu)锳，且純合突變的小鼠在出生11 d后開始出現(xiàn)晶狀體渾濁; Crygs基因不僅編碼晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白，而且參與晶狀體上皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡。Yuan等[6]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除家兔αA-crystallin基因造成3～52 bp缺失突變 ，可造成新生家兔先天性白內(nèi)障，表現(xiàn)為小眼球畸形、眼球渾濁、晶狀體過早萎縮等特征。認(rèn)為該動物模型提示應(yīng)該進(jìn)一步研究人類αA-crystallin基因突變與先天性白內(nèi)障的關(guān)聯(lián)研究。

UPL大鼠(The Upjohn Pharmaceuticals Limited rat)因其白內(nèi)障為常染色體半顯性遺傳方式，且具有純合子發(fā)病早而雜合子發(fā)病遲的特點(diǎn)，成為獨(dú)特的白內(nèi)障動物模型。Yamashita等[7]利用UPL封閉群大鼠定位白內(nèi)障相關(guān)基因，表明Cx50基因的第340位堿基由C突變?yōu)門導(dǎo)致相應(yīng)的精氨酸變?yōu)樯彼?，可延緩白?nèi)障的發(fā)病。該基因編碼產(chǎn)物的分子特征也許可為延緩白內(nèi)障發(fā)病的藥物研發(fā)提供更好的靶點(diǎn)。Kondo等[8]研究顯示, CF1小鼠中存在出生后22 d完全發(fā)展為白內(nèi)障的小鼠。該模型小鼠具有易飼養(yǎng)和可繁殖，晶狀體上皮細(xì)胞和晶狀體皮質(zhì)空泡化, 晶狀體纖維膨脹, 許多細(xì)胞核固縮的特點(diǎn)。通過雜交和回交并對子代進(jìn)行全基因組測序顯示該模型小鼠的癥狀通過常染色體隱性的方式遺傳,且該模型的相關(guān)基因?yàn)锽CAR3。該基因第7外顯子區(qū)堿基C的插入產(chǎn)生終止密碼子提前終止BCAR3蛋白的翻譯。認(rèn)為該模型為白內(nèi)障發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制和BCAR3蛋白的功能提供更多的信息[9]。

基因組位點(diǎn)定向敲入或敲除的方法可得到特定基因變異的先天白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物。Jonathan等[10]通過比較野生型小鼠和敲入可引起人類遺傳性白內(nèi)障的αB-R120G突變的小鼠中P62蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示敲入αB-R120G突變的小鼠P62蛋白表達(dá)上調(diào)，他們認(rèn)為該模型可用于探索減少晶狀體蛋白聚集方法的研究。近年來研究顯示, 晶狀體細(xì)胞具有自噬功能[11]，P62的累積被認(rèn)為是自噬功能受抑制的標(biāo)志[12,13]。晶狀體細(xì)胞自噬功能受抑制可導(dǎo)晶狀體細(xì)胞喪失抗應(yīng)激和分化能力，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的形成[14]。晶狀體內(nèi)蛋白分子的聚集和晶狀體自噬功能被抑制之間的關(guān)聯(lián)性值得進(jìn)一步研究。通過減少細(xì)胞內(nèi)有害蛋白的積累來維持晶狀體細(xì)胞的自噬功也許能有助于闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。

2 創(chuàng)傷性白內(nèi)障

創(chuàng)傷性白內(nèi)障是由于晶狀體受傷特別是穿孔傷之后, 房水由囊膜進(jìn)入晶體, 晶體內(nèi)水溶性蛋白大量丟失，DNA合成以及細(xì)胞分裂減慢，引起晶狀體受傷部位混濁并很快波及到晶體的周邊部，最終導(dǎo)致整個晶體的混濁。目前最常采用針頭刺穿晶狀體或刺劃晶狀體前囊形成創(chuàng)傷，控制白內(nèi)障形成過程以建立創(chuàng)傷性白內(nèi)障的模型。Xiao等[15]用注射器針頭穿刺晶狀體前囊，快速誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可建立晶狀體囊膜損傷的小鼠模型。該模型可用于前囊下白內(nèi)障和晶體后囊混濁的生物學(xué)研究以及新療法的療效研究。Kwon等[16]用外科損傷法建立了干眼和非干眼型小鼠白內(nèi)障模型, 用以評估白內(nèi)障手術(shù)后角膜炎癥細(xì)胞浸潤、血管和淋巴管的生成, 表明干眼型的小鼠白內(nèi)障模型容易誘發(fā)血管和淋巴管的形成，并且更易誘發(fā)眼角膜組織的炎癥反應(yīng)，因此建議干眼型白內(nèi)障手術(shù)后應(yīng)輔以抗炎治療以減少眼角膜和前房的炎癥。

3 紫外線誘導(dǎo)白內(nèi)障

紫外輻射是晶狀體混濁化及白內(nèi)障形成的主要外部因素之一, 其機(jī)制是紫外線激發(fā)晶狀體產(chǎn)生自由基, 加劇氧化應(yīng)激過程, 損傷細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)等。構(gòu)建該類型白內(nèi)障動物模型時將動物麻醉固定后，采用光照強(qiáng)度已知且恒定的紫外燈照射實(shí)驗(yàn)動物眼球。Galichanin等[17]建立了一種用B型紫外線(ultraviolet ray B, UVR-B)誘導(dǎo)白內(nèi)障的大鼠模型, 并用免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄PCR探索該類型白內(nèi)障的分子機(jī)制, 提供了一種研究UVR-B誘導(dǎo)的白內(nèi)障發(fā)生過程中分子特征的方法。Mody等[18]建立了一種檢測豚鼠對UVR-B誘發(fā)的白內(nèi)障最大耐受劑量的方法, 并比較了豚鼠、大鼠和家兔對UVR-B的敏感性, 為UVR-B誘導(dǎo)豚鼠白內(nèi)障毒性的估計提供一個合適的方法。Ishikawa等[19]利用衰老標(biāo)記蛋白-30(SMP30)基因敲除的小鼠為模型探究維生素C對UVR-B誘導(dǎo)的晶狀體渾濁的影響, 顯示維生素C的缺乏可增加小鼠對UVR-B誘導(dǎo)白內(nèi)障的易感性。Stefano等[20]用不同強(qiáng)度的輻射劑量照射Patched 基因雜合的小鼠, 研究輻射誘發(fā)白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。他認(rèn)為闡明此類白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制,除了要分析晶狀體上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及隨后的纖維化改變之外, 還要分析潛在的遺傳因素對此類白內(nèi)障的影響。De Stefano等[21]研究顯示Patched1 (Ptch1)基因雜合的小鼠可自發(fā)形成白內(nèi)障, 且對電離輻射誘導(dǎo)形成白內(nèi)障更敏感, 對該基因型小鼠進(jìn)行2 Gy X線輻射劑量處理可誘發(fā)白內(nèi)障。研究顯示當(dāng)Ptch1缺乏時, 其配體Shh協(xié)同轉(zhuǎn)化生長因子B共同激活上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化, 促進(jìn)Ptch1相關(guān)的白內(nèi)障的發(fā)病。認(rèn)為該小鼠模型是一種新型有效的白內(nèi)障動物模型, 可用于研究白內(nèi)障形成的分子機(jī)制。

4 糖性白內(nèi)障

糖性白內(nèi)障是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，Zhang 等[22]用硫醇轉(zhuǎn)移酶(TTase)基因敲除小鼠研究TTase在氧化還原平衡以及抗氧化應(yīng)激過程中的作用，顯示TTase缺乏在高糖誘導(dǎo)的小鼠白內(nèi)障形成的早期階段起作用，表明糖性白內(nèi)障與抗氧化酶活性下降有關(guān)。

該動物模型形成主要通過腹腔、球后或皮下注射一定濃度的半乳糖溶液。Ji等[23]用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%的半乳糖溶液注射21 日齡大鼠, 18 d后造成大鼠半乳糖性白內(nèi)障模型，該模型大鼠醛糖還原酶基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，在造模后6 d達(dá)到最高。認(rèn)為該模型大鼠可用于研究糖性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制和抗白內(nèi)障候選藥物的篩選。鏈脲佐菌素(STZ)是從鏈霉菌屬菌株分離出的抗生素 ,可誘導(dǎo)大鼠、豚鼠等產(chǎn)生Ⅱ型糖尿病動物模型。Patil等[24]給出生后2 d大鼠注射鏈脲佐菌素(STZ)造成糖尿病模型，研究前驅(qū)糖尿病和白內(nèi)障病因的之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示30%的大鼠為高血糖癥并形成白內(nèi)障，認(rèn)為氧化應(yīng)激和多元醇旁路可能參與耐糖量減低相關(guān)的晶狀體異常的形成，且該大鼠模型可用于耐糖量減低相關(guān)晶狀體異常的研究。郝麗娜等[25]采用STZ制作大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型，表明葛根素腹腔注射和球旁注射給藥途徑對糖尿病性大鼠晶狀體上皮細(xì)胞均具有保護(hù)作用，且療效相當(dāng)。Wang等[26]通過腹腔注射STZ誘導(dǎo)大鼠的糖性白內(nèi)障模型，并向患糖尿病的大鼠注射丁苯酞(NBP)，顯示丁苯酞通過抑制氧化應(yīng)激延遲糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。

5 硒性白內(nèi)障

亞硒酸鹽可與房水中少量的H2O2反應(yīng)生成不同形式的活性氧，改變晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致晶狀體混濁。該動物模型的建立主要是通過對實(shí)驗(yàn)動物口服或注射高濃度亞硒酸鈉溶液，目前建模成功的實(shí)驗(yàn)動物有小鼠、大鼠以及家兔。氧化應(yīng)激通過轉(zhuǎn)化生長因子-β激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TG2)在白內(nèi)障的形成過程中起關(guān)鍵作用，Lee等[27]用亞硒酸鈉誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障模型研究TG2是否參與該白內(nèi)障模型的形成以及TG2抑制劑(半胱胺)是否能抑制該模型的形成，結(jié)果顯示半胱胺可抑制亞硒酸鈉誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障形成，認(rèn)為半胱胺可作為藥物干預(yù)以預(yù)防或延緩白內(nèi)障的形成。

6 體外誘導(dǎo)白內(nèi)障

體外誘導(dǎo)白內(nèi)障模型是在不同條件下對實(shí)驗(yàn)動物晶狀體進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察晶狀體上皮細(xì)胞的形態(tài)并檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。韓笑等[28]用不同濃度的高糖溶液處理人的晶狀體上皮細(xì)胞并檢測高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)的變化, 結(jié)果顯示高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響SUMO mRNA表達(dá), 推測SUMO參與高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷過程。李平華等[29]用過氧化氫處理體外培養(yǎng)的家兔晶狀體以建立H2O2體外氧化損傷性白內(nèi)障模型，并檢測晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率以及Fas蛋白表達(dá)。結(jié)果表明過氧化氫可能是通過上調(diào)Fas蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，參與白內(nèi)障的發(fā)病。Sampath 等[30]用δ-過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)激動劑處理體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體, 誘導(dǎo)體外白內(nèi)障模型。他們認(rèn)為晶體體外培養(yǎng)可以用來評估PPAR激動劑誘導(dǎo)白內(nèi)障的潛力，并研究白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制。Li等[31]用白藜蘆醇處理體外培養(yǎng)的人和豬的晶狀體上皮細(xì)胞，顯示白藜蘆醇預(yù)防晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是通過表達(dá)Forkhead box O (FoxO1A, FoxO3A,and FoxO4)介導(dǎo)，他們認(rèn)為該方法對研究氧化相關(guān)的晶狀體病如白內(nèi)障形成的研究具有重要意義。Du等[32]用ZnCl2處理體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞，表明適當(dāng)鋅濃度的Zn2+對體外培養(yǎng)的人眼晶狀體上皮細(xì)胞輻射損傷具有保護(hù)作用。其機(jī)制為Zn2+降低線粒體功能障礙和活性氧過度產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，從而維持細(xì)胞的正常生理功能。

7 白內(nèi)障模型構(gòu)建的評價指標(biāo)

白內(nèi)障動物模型構(gòu)建后，通過觀察晶狀體的渾濁度和測定晶狀體細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的生化指標(biāo)確定動物模型的質(zhì)量。其中，晶狀體渾濁度分類方法較多，以世界衛(wèi)生組織白內(nèi)障晶狀體渾濁標(biāo)準(zhǔn)分級(1995)為例: 晶狀體渾濁Ⅰ期: 晶狀體后極部后囊下皮質(zhì)內(nèi)有細(xì)點(diǎn)狀渾濁，并排列成環(huán)形，可伴有空泡; Ⅱ期: 晶狀體后極部后囊下皮質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)盤狀渾濁且伴有空泡，嚴(yán)重者在盤狀渾濁的周圍出現(xiàn)不規(guī)則的條紋狀渾濁向赤道部延伸，盤狀渾濁也可向皮質(zhì)深層擴(kuò)展, 可呈寶塔狀外觀，前極部前囊下皮質(zhì)內(nèi)也可出現(xiàn)細(xì)點(diǎn)狀渾濁及空泡，視力可能減退; Ⅲ期:晶狀體后極部后囊下皮質(zhì)內(nèi)程蜂窩狀渾濁，后極部較致密，向赤道部逐漸稀薄，伴有空泡，可有彩虹點(diǎn), 前囊下皮質(zhì)內(nèi)渾濁加重, 有不同程度的視覺障礙; Ⅳ期: 晶狀體完全渾濁, 嚴(yán)重視力障礙。

測定晶狀體勻漿混懸液的生化指標(biāo): 建模成功后，晶狀體中脂質(zhì)過氧化指標(biāo)丙二醛(MDA)含量應(yīng)明顯增大[33]; 酶促類抗自由基指標(biāo)的氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平應(yīng)顯著下降[34,35]。

8 展望

隨著不同類型白內(nèi)障動物模型的建立以及基因編輯等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前對白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識有了很大提高，已研發(fā)出許多治療白內(nèi)障的藥物和外科學(xué)方法。但白內(nèi)障發(fā)病的確切機(jī)制目前仍未完全闡明，藥物也只能在一定程度上對白內(nèi)障起到治療作用而不能治愈。根據(jù)病因和發(fā)病進(jìn)程建立相應(yīng)白內(nèi)障動物模型，仍是研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制、篩選藥物靶點(diǎn)和完善手術(shù)方案的重要平臺。大鼠、小鼠由于體型小易于固定、廉價且易飼養(yǎng)等特點(diǎn)被用于構(gòu)建各種疾病動物模型。樹鼩作為接近靈長類的小型哺乳動物，具有飼養(yǎng)周期短、經(jīng)濟(jì)成本較低的優(yōu)點(diǎn); 且具有發(fā)達(dá)的視覺系統(tǒng)、較大的眼睛、易于眼部、的手術(shù)操作等優(yōu)勢。與其他動物相比，樹鼩晶狀體自發(fā)熒光值受年齡影響較小, 在晶狀體病變的研究中是較好的動物模型[36]，在白內(nèi)障動物模型構(gòu)建中有一定的應(yīng)用潛力。由于晶狀體細(xì)胞體外培養(yǎng)維持時間較短，目前仍缺乏白內(nèi)障發(fā)病的動態(tài)數(shù)據(jù)，尤其是亞細(xì)胞水平。采用永生化細(xì)胞系雖不能完全模擬完整的晶狀體，但可以從亞細(xì)胞水平進(jìn)行長期實(shí)驗(yàn)，也許可用于研究白內(nèi)障發(fā)病過程晶狀體細(xì)胞中基因表達(dá)水平的變化。

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