劉坤梅，申政磊 綜述，曾 云△ 審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/云南省血液病研究中心，昆明 650032； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院血液科，昆明 650100)

目前研究顯示，腫瘤細(xì)胞獲取氧氣通過以下3個途徑：(1)經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞供血途徑，血管內(nèi)皮的變化基本與缺氧息息相關(guān)。(2)腫瘤細(xì)胞為克服自身缺氧而發(fā)生的適應(yīng)性改變——血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)。(3)介于二者之間的機(jī)制，包括馬賽克血管生成，血管生成共選擇等。其中VM理論近年來受到學(xué)者關(guān)注，現(xiàn)研究證明其對傳統(tǒng)腫瘤血管生成理論的一個重要補(bǔ)充，不僅解釋了經(jīng)典血管生成理論難以解釋的一些問題，也為解決抗腫瘤血管新生療效不佳進(jìn)而尋找新的抑制腫瘤血管治療提供了思路。 目前，針對白血病與VM的文獻(xiàn)還較少。本課題組從2014年對白血病中與VM相關(guān)問題進(jìn)行探討，現(xiàn)就白血病與VM的研究進(jìn)展綜述如下。

1 VM概述

1999年MANIOTIS等[1]在對人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究中發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤細(xì)胞通過自身變形并與細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)相互作用，形成一種可輸送血液的管道、可模擬血管壁結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，從而重塑腫瘤的微循環(huán)，這些形成的系統(tǒng)可與宿主血管相連通，并使腫瘤獲得血液供應(yīng)，此現(xiàn)象被命名為 VM ，進(jìn)而提出一種不依賴機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的腫瘤血供模式。VM的提出對以內(nèi)皮依賴性血管是腫瘤微循環(huán)惟一方式的傳統(tǒng)觀念提出了挑戰(zhàn)，同時也是研究腫瘤相關(guān)血管生成的重要補(bǔ)充。目前在惡性黑色素瘤、上皮樣肉瘤及腺泡型橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、胸膜間皮肉瘤、炎性乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌、肝癌等中都發(fā)現(xiàn)存在VM[2-6]。其特征是：(1)血管壁主要由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成；(2)血管腔內(nèi)層不是由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，而是一層過碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)染色呈陽性基底膜樣結(jié)構(gòu)；(3)內(nèi)皮特異標(biāo)記的免疫組織化學(xué)檢測[凝血因子Ⅷ(FⅧ)、CD31、CD34、KDR和荊豆素(Ulex)等]呈陰性反應(yīng)；(4)腫瘤干細(xì)胞(CSC)可能參與了VM的形成。與VM的發(fā)生及調(diào)控相關(guān)的因素包括缺氧、遷移誘導(dǎo)蛋白(Mig-7)、蛋白激酶受體A2(EphA2)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)等。

VM的價值在于其與腫瘤的惡性程度、腫瘤的級別、侵襲性、分期及CSC等緊緊聯(lián)系在一起。MANIOTIS等[1]發(fā)現(xiàn)無論是普通的黑色素瘤細(xì)胞或者是低侵襲性的黑色素瘤細(xì)胞，在設(shè)置相同的體外環(huán)境中都不會形成侵襲性黑色素瘤細(xì)胞所形成的VM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而高侵襲性的黑色素瘤細(xì)胞在體外環(huán)境中則可形成。一些在肝細(xì)胞癌、平滑肌肉瘤、胃腸道間質(zhì)瘤等腫瘤中多有相似的結(jié)論。在研究惡性膠質(zhì)瘤中，發(fā)現(xiàn)VM的形成過程與CSC有著密切聯(lián)系。國內(nèi)學(xué)者檢測了肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD34在肝癌VM形成中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過自身變形形成VM，并且在形成VM的癌細(xì)胞表達(dá)CD133和CD34高于未形成VM的細(xì)胞[7]，作者認(rèn)為此發(fā)現(xiàn)間接說明了在形成VM的肝癌細(xì)胞中，CSC高表達(dá)?？梢钥吹?，VM涉及的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、CSC、間質(zhì)細(xì)胞等。

2 白血病與VM

目前，在白血病中有關(guān)VM的研究極少，原因是：(1)白血病是全身彌漫性腫瘤，主要累及骨髓、外周血等血液循環(huán)豐富的部位，髓外形成包塊、病灶的情況相對較小。(2)白血病細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，其寄生在血液中，分布相對較廣，缺氧的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于局限生長的實(shí)體瘤細(xì)胞。(3)“種子和土壤”假說在血液疾病發(fā)展、研究中一直占據(jù)經(jīng)典地位，這些年研究中心和方向始終放在種子上；而對土壤的研究和相關(guān)報道嚴(yán)重不足[8-10]。(4)白血病種類多、分型復(fù)雜、細(xì)胞個體差異大，想要在繁多的白血病類型中尋找共同的特征難度大。(5)白血病是干/祖細(xì)胞疾病，大家廣泛認(rèn)同腫瘤細(xì)胞遺傳、細(xì)胞表型、細(xì)胞類別等方面特征決定其轉(zhuǎn)移能力，而腫瘤特異轉(zhuǎn)移器官的微環(huán)境對于腫瘤擴(kuò)散的影響認(rèn)識不足。(6)白血病細(xì)胞模型構(gòu)建、三維培養(yǎng)、共培養(yǎng)體系難度大。

2.1骨髓等活檢標(biāo)本中存在VM樣結(jié)構(gòu)的可能性 眾所周知，骨髓活檢標(biāo)本中與VM相關(guān)的結(jié)構(gòu)主要包括基質(zhì)結(jié)構(gòu)(間質(zhì)和PAS樣物質(zhì))、微血管密度(MVD)、幼稚前體細(xì)胞異常定位(ALIP)和前ALIP，CD133+的細(xì)胞(包括CD133+的白血病細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞)等[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)及其他急性白血病(AL)患者骨髓組織中，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)典內(nèi)皮血管的MVD明顯增加[12]，這與目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤細(xì)胞促進(jìn)血管生成相一致。目前，針對VM的研究主要集中在實(shí)體腫瘤(包括黑色素瘤，乳腺癌，膠質(zhì)瘤等)，活檢標(biāo)本中基本采用CD133+細(xì)胞來驗(yàn)證VM結(jié)構(gòu)，認(rèn)為CD133+的腫瘤細(xì)胞是形成VM的關(guān)鍵成分，進(jìn)而將其與CSC聯(lián)系起來，認(rèn)為CSC參與了VM的形成，并認(rèn)為這是造成惡性腫瘤難以治療的因素之一。骨髓內(nèi)CD133+的細(xì)胞包括CD133+的白血病細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPO)，有研究觀察了CD133+細(xì)胞在骨髓標(biāo)本中的表達(dá)，分析比對CD133+的白血病細(xì)胞和EPO的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在AL骨髓中CD133陽性表達(dá)主要在白血病細(xì)胞上(80%)；而表達(dá)CD133的EPC細(xì)胞也明顯增多，尤其是在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中[13]；但最為關(guān)鍵的是這種表達(dá)在免疫組織化學(xué)切片中無法區(qū)分是VM還是經(jīng)典血管通路，因?yàn)锳L細(xì)胞基本以彌漫性分布，即便是靠近骨小梁的位置，也很少有局限性的病灶出現(xiàn)。ALIP認(rèn)為是由白血病前體細(xì)胞組成的，是白血病復(fù)發(fā)進(jìn)展的根源，某種程度上相當(dāng)于白血病細(xì)胞niche，該類細(xì)胞間的微循環(huán)關(guān)系理論上應(yīng)該與VM相關(guān)。有研究對AL緩解標(biāo)本中ALIP結(jié)構(gòu)中細(xì)胞之間及細(xì)胞周圍進(jìn)行觀察，未發(fā)現(xiàn)PAS染色陽性的微血管結(jié)構(gòu)。目前在活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)與VM樣結(jié)構(gòu)最接近的是2014年COGLE等[6]通過NSG小鼠動物模型和30例急性粒細(xì)胞白血病(AML)患者尸體肝組織中出現(xiàn)了白血病細(xì)胞浸潤；并利用種屬特異性抗體，鑒定出一組與門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的白血病細(xì)胞，作者把它們命名為血管組織相關(guān)的白血病細(xì)胞(vascular tissue-associated AML cells，V-AML)，其表型主要為mCD31+hCD45+，約占全部門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的2%，更為重要的是通過mCD31+免疫磁珠分選AML小鼠肝組織中V-AML細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)96%含有FLT3-ITD融合基因，從而提示AML的來源。通過FISH發(fā)現(xiàn)V-AML細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間存在一定的核型融合(0～1%)；通過比對AML細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)V-AML細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD105抗原(一種反映內(nèi)皮功能活化及血管新生的標(biāo)記)，該類V-AML細(xì)胞的增殖活性較noV-AML細(xì)胞強(qiáng)4倍以上，提示V-AML細(xì)胞在AML病情變化中有重要作用。但該類細(xì)胞僅僅只是與內(nèi)皮相關(guān)，自身并未形成管腔樣結(jié)構(gòu)，只是黏附于形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞附近，故不是VM樣結(jié)構(gòu)[14]。綜上所述，作者認(rèn)為在AL骨髓組織中存在VM樣結(jié)構(gòu)可能性很小。

2.2VM本質(zhì)上是腫瘤細(xì)胞內(nèi)皮轉(zhuǎn)化 目前研究顯示，在實(shí)體瘤中形成VM的細(xì)胞主要是CD133+的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞的來源有以下可能：(1)從腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生/表達(dá)角度來看，相關(guān)文獻(xiàn)顯示腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生高表達(dá)MMP類物質(zhì)，MMP活化后可促進(jìn)EMC中的成分層黏連蛋白5γ2(Laminin-5γ2)水解成片段,這些片段沉積于腫瘤外環(huán)境中為VM形成提供空間結(jié)構(gòu)；腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)多潛能胚胎細(xì)胞表型,或出現(xiàn)多種與內(nèi)皮細(xì)胞表型有關(guān)的基因表型可能是VM模擬血管變形的重要分子基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞黏附分子促進(jìn)VM管壁形成；同時腫瘤細(xì)胞在生長過程中還分泌一些EMC(PAS陽性物質(zhì)、Ⅳ膠原)參與構(gòu)成VM的基底膜樣結(jié)構(gòu);腫瘤細(xì)胞之間的黏附是VM形成的必要條件,其中EphA2與VE-cadherin二者共同聚集在細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附點(diǎn),促進(jìn)了構(gòu)成VM周圍腫瘤細(xì)胞彼此之間的黏附[15-17]。(2)從CSC角度來看，研究顯示CSCs能分化為腫瘤間質(zhì)細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞，同時也可分化為異質(zhì)性的子代腫瘤細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)分化能力對于腫瘤組織中非宿主血管內(nèi)皮來源的腫瘤血管新生具有重要作用。這種轉(zhuǎn)分化能力不但具有普遍性，而且具有異質(zhì)性。有學(xué)者在CD133+膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、乳腺癌、卵巢癌、腎癌研究均表明CSCs在特定條件下可能轉(zhuǎn)分化為腫瘤來源的內(nèi)皮細(xì)胞；而在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)并不是所有的CSCs都能夠轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中將CSCs分為CD133+/CD144-、CD133+/CD144+、CD133-/CD144+和CD133-/CD144-4個亞群，其中CD133+/CD144+只能轉(zhuǎn)分化為EPC再進(jìn)一步分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，而CD133+/CD144-細(xì)胞亞群能夠轉(zhuǎn)分化為腫瘤來源性內(nèi)皮細(xì)胞[18]。在缺氧的三維培養(yǎng)中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞明顯表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31、CD34、KDR和vWF，分化成血管內(nèi)皮樣細(xì)胞并形成管樣結(jié)構(gòu)[19]。體外培養(yǎng)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞，部分能分化成平滑肌樣細(xì)胞，形成血管樣結(jié)構(gòu)，并表達(dá)內(nèi)皮相關(guān)基因包括E-phA2、Neuropilin-239和Laminin52[20]。上述研究顯示，CD133+細(xì)胞是VM形成主要細(xì)胞?？赡艽鸢甘荂D133+是EPC分化為內(nèi)皮細(xì)胞過程中最主要的影響因素，是EPC最主要的特征；無論是腫瘤細(xì)胞或CSC，形成VM樣的前提條件是發(fā)生可塑性的內(nèi)皮分化，CD133表達(dá)的增強(qiáng)正是內(nèi)皮分化的直接體現(xiàn)。

2.3白血病細(xì)胞中是否存在VM的細(xì)胞 缺氧是形成VM最根本因素，因?yàn)閂M正是腫瘤細(xì)胞為克服缺氧環(huán)境而主動塑造的一種供血通道。針對白血病細(xì)胞形成VM樣結(jié)構(gòu)的根本原因是供氧不足，因?yàn)榘籽〖?xì)胞彌散分布在血液中，顯然這種概率較實(shí)體瘤而言相對較低。有研究探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在形成MVD時，對比分析了13例AL及23例達(dá)到CR的骨髓標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)AL來源的BMSCs分泌更多的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)與胰島素生長因子-1(IGF-1)；AL來源的CD133+/CD34+BMSCs能形成VM，這種能力通過PI3/r-GTP激酶途徑起作用，如果阻斷該途徑就可抑制VM形成。研究發(fā)現(xiàn)CSC有EPC作用，可分化成內(nèi)皮樣細(xì)胞，能夠自我更新、分化和無限增殖，進(jìn)而形成管腔樣結(jié)構(gòu)來運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)[21-22]。

為尋找白血病細(xì)胞是否具備形成VM的能力，有研究從所有可能表達(dá)CD133的細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD133+和CD133-的白血病細(xì)胞、CD34+/CD38-和CD34+/CD38+白血病干細(xì)胞、CD33+PML/RARα+的APL細(xì)胞均不具備形成VM樣結(jié)構(gòu)的能力，而EC、CD133+/CD34+BMSCs、EPC可以形成管腔樣結(jié)構(gòu)[23]。那么是不是白血病中不存在這種類型的細(xì)胞呢？有研究通過在EPC培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)AML細(xì)胞發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞本身所具有的造血細(xì)胞表型出現(xiàn)下降，而內(nèi)皮樣表型逐漸增強(qiáng)，進(jìn)而產(chǎn)生表型為CD45neg、CD105+acLDL+VEGFR2+UEA1+的內(nèi)皮樣細(xì)胞，作者把該類細(xì)胞命名為白血病衍生的內(nèi)皮克隆單位形成細(xì)胞(leukemia-derived endothelial colony-forming cells，L-ECFC)。與正常內(nèi)皮細(xì)胞和EPC比較，L-ECFC在Matrigel膠三維培養(yǎng)中更容易形成管腔樣結(jié)構(gòu)，CD14、CD115等髓系標(biāo)志和全髓標(biāo)志CD45降低，而CD105,UEA-1、CD146和VEGFR2等標(biāo)志增強(qiáng)[24-25]；作者比對了肝組織中V-AML、L-ECFC、noV-AM 3種細(xì)胞的致白血病效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)(3～10)×103mCD31+V-AML細(xì)胞、3×104noV-AML細(xì)胞不會導(dǎo)致NSG小鼠發(fā)生白血病；而當(dāng)把一定數(shù)量的L-ECFC回輸白血病NSG小鼠體內(nèi)后，其又會恢復(fù)為白血病表型，進(jìn)而引發(fā)白血病的發(fā)生。由此可知，白血病中也存在類似VM機(jī)制的變化，不同之處在于沒有實(shí)體腫瘤那么明顯，而是隱藏在調(diào)控白血病細(xì)胞生長的niche中。

綜上所述，本研究認(rèn)為VM某種程度上是腫瘤細(xì)胞為克服缺氧而適應(yīng)其周圍環(huán)境產(chǎn)生變化的一種表現(xiàn)形式，其本質(zhì)與腫瘤細(xì)胞可塑性內(nèi)皮分化密切相關(guān)，深入探討其本質(zhì)對闡明白血病細(xì)胞的微環(huán)境niche具有重要意義。