張碧瑤,劉利根,石心紅
(中國藥科大學中藥制劑教研室,南京 211198)
厚樸是木蘭科植物凹葉厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.或厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。在湖北北部、陜西南部、四川、甘肅東南部、河南東南部和貴州東北部等地分布廣泛,其中四川、湖北和安徽為較優(yōu)質的產區(qū)[2],其藥用部位主要是樹皮,其中根皮和干皮中厚樸酚與和厚樸酚含量最高[3],主治痰飲喘咳、濕滯傷中、食積氣滯和腹脹便秘[4]等癥。厚樸的有效成分有厚樸酚、和厚樸酚、四氫厚樸酚、異厚樸酚、厚樸醛、丁香脂素和厚樸木脂素等[5],其中主要的有效活性成分是厚樸酚[6]與和厚樸酚[7],二者互為同分異構體,分子式為C18H18O2。厚樸酚為白色至黃褐色粉末,單體為無色針狀結晶[8];和厚樸酚為白色粉末,單體為無色鱗片狀晶體,二者均易溶于苯、乙醚、氯仿和乙醇等,均難溶于水?!吨袊幍洹?015年版規(guī)定,厚樸酚與和厚樸酚二者在厚樸中的含量不得少于2.0%[9]?,F(xiàn)代藥理研究表明,厚樸酚與和厚樸酚這2種成分在厚樸中的藥用作用有很大關系。厚樸酚有導致肌肉松弛、抗菌[10]、抑制血小板凝集和抗腫瘤[11]等作用,臨床上主要使用厚樸酚制作抗菌和抗真菌藥物。和厚樸酚對腫瘤細胞有很好的療效,可誘導腫瘤細胞凋亡[12]、抑制腫瘤轉移以及促進腫瘤細胞分化[13-16];和厚樸酚衍生物有抗焦慮活性[17],在臨床上有廣闊的應用前景。
目前,中藥溶劑提取最常用的方法為煎煮法[18]、超聲提取法、索氏提取法[19]、微波提取法[20]和超臨界流體萃取等。為適應工業(yè)化生產,根據(jù)厚樸酚與和厚樸酚易溶于乙醇且具有酚羥基等特點,本實驗通過單因素水平實驗分析了pH值、乙醇體積分數(shù)、液料比和提取次數(shù)4個因素對厚樸酚與和厚樸酚提取率的影響,通過設計正交實驗進一步優(yōu)化提取條件。該實驗旨在建立和優(yōu)選厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的提取工藝模式,為深入開發(fā)和利用厚樸提供理論依據(jù)。
1.1儀器 LC-20AT型高效液相系統(tǒng):(日本島津公司);色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);KH-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);pH精密試紙(上海三愛思試劑有限公司)。
1.2試藥 厚樸藥材(購于湖北恩施);無水乙醇,濃硫酸(分析純,南京化學試劑有限公司);氫氧化鈉(湖南爾康制藥有限責任公司);甲醇(色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)。
2.1厚樸酚與和厚樸酚含量測定的方法學考察
2.1.1色譜條件 色譜柱:C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇-水(78∶22);檢測波長:294 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:40 ℃。在上述色譜條件下,和厚樸酚與厚樸酚得以分離,保留時間分別為10.01和14.48 min。
2.1.2線性關系考察 稱取厚樸酚與和厚樸酚適量,置于100 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成混合對照品溶液。分別取混合對照品溶液0.5,2,4,6,8和10 mL,分別置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成不同質量濃度梯度的系列對照品溶液,進樣20 μL,記錄色譜圖。以對照品質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線。
得到厚樸酚與和厚樸酚的線性回歸方程分別為y1=3×107x1+33 112和y2=3×107x2+ 24 121,r=0.999 9。結果表明,厚樸酚與和厚樸酚在0.004 5~0.09和0.007 2~0.144 mg·mL-1范圍內,線性關系良好。
2.1.3精密度實驗 取2.1.2項下制備的對照品溶液,按照2.1.1項下色譜條件,注入高效液相色譜儀,分別連續(xù)測定6次,記錄色譜圖,測定峰面積,計算得厚樸酚與和厚樸酚的RSD值分別為1.71%和1.13%,結果表明,含量測定的精密度良好,符合定量測定的要求。
2.1.4穩(wěn)定性考察 取2.1.2項下制備的對照品溶液,室溫避光放置,分別于0,3,6,9,12和24 h進樣測定,進樣記錄峰面積,計算RSD值分別為0.01%和1.13%。結果表明,厚樸酚與和厚樸酚在24 h內穩(wěn)定性良好。
2.1.5重復性實驗 按照2.1.2項下方法平行制備6份對照品溶液,經微孔濾膜過濾后分別注入高效液相色譜儀,記錄峰面積,計算厚樸酚與和厚樸酚的RSD值均為0.01 %,結果表明,含量測定的重復性良好。
2.1.6加樣回收率實驗 在3份對照品溶液中依次加入不同質量濃度的厚樸酚與和厚樸酚對照品,進樣20 μL,計算得厚樸酚與和厚樸酚的平均加樣回收率分別為101.6%和100.6%,RSD值分別為1.60%和0.90%。
2.2厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量測定 厚樸藥材用藥材粉碎機打成粉末,過3號篩,精密稱取0.2 g,置于25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,浸泡24 h后,精確量取5 mL提取液,置于25 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。取20 μL注入高效液相色譜儀進行含量測定。
《中國藥典》2015年版規(guī)定,厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量應不少于2.0%。含量測定結果表明,每1.0 g厚樸藥材中含有厚樸酚與和厚樸酚的總量為2.604×10-2g,含量在2.0%以上。
圖1HPLC圖
A.對照品;B.陰性對照;C.供試品;1.和厚樸酚;2.厚樸酚。
Fig.1 HPLC chromatograms
A.reference substance;B.negative control;C.sample;1.honokiol;2.magnolol.
2.3厚樸酚與和厚樸酚的提取 稱取厚樸藥材粉末10 g,置于燒杯中,按照相應的液料比加入不同體積分數(shù)和pH值的乙醇溶液,將燒杯密封,放入超聲清洗儀中,設置超聲清洗儀參數(shù)為25 ℃,頻率為100 Hz,提取2次,每次提取完成后用真空泵減壓抽濾,合并提取液。精確量取提取液0.1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。取20 μL注入高效液相色譜儀進行含量測定。
2.4單因素實驗
2.4.1不同體積分數(shù)乙醇 稱取厚樸藥材粉末10 g,置于10倍量體積、pH值為7的不同體積分數(shù)的乙醇溶液中,超聲提取1次,0.5 h。取提取液1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,進樣20 μL,計算提取率。選擇體積分數(shù)為20%,35%,50%,65%,80%和95%的乙醇溶液作為研究水平。實驗結果表明,厚樸酚與和厚樸酚的提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高先增加后逐漸趨于平穩(wěn),在乙醇體積分數(shù)為65%時即達到峰值,故乙醇體積分數(shù)的水平選擇為50%,65%和80%。
2.4.2不同pH值 稱取厚樸藥材粉末10 g,置于10倍量體積、不同pH值的體積分數(shù)為65%的乙醇溶液中,超聲提取1次,0.5 h。pH值選擇6,7,8,9和10為研究水平。實驗結果表明,厚樸酚與和厚樸酚的提取率隨著pH值的增加而增加。因pH值為10時,溶液顏色為深綠色,懷疑在此pH值時,部分厚樸酚與和厚樸酚被氧化,因此不選擇pH值為10進行實驗,選擇pH水平因素為7,8和9。
2.4.3不同提取次數(shù) 稱取厚樸藥材粉末10 g,置于10倍量體積、pH值為7的體積分數(shù)為80%的乙醇溶液中,提取數(shù)次,每次0.5 h。取提取液1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,進樣20 μL,計算提取率。選擇提取次數(shù)為1,2,3,4和5作為研究水平。實驗結果表明,提取率隨提取次數(shù)的增多而增加,在提取3次時達到平衡,在提取2次時能達到90%以上,但在提取次數(shù)為1次時,提取率已經達到80%,可認為提取次數(shù)對提取率的影響較小,在設計正交表格時不列入考慮范圍,在進行實驗時選擇提取2次作為實驗條件。
2.4.4不同液料比 單因素實驗稱取厚樸藥材粉末10 g,置于不同體積、pH值為7的體積分數(shù)為65%的乙醇溶液中,提取1次,0.5 h。液料比選取5∶1,8∶1,10∶1,12∶1和15∶1作為研究水平。實驗結果表明,隨著液料比的增加對于堿性乙醇超聲提取的提取率也隨之增加,因此選擇5∶1,10∶1和15∶1共3個液料比作為水平因素。
2.5正交實驗設計及結果分析 在藥材厚樸粉末厚樸酚與和厚樸酚提取的正交實驗設計中,依據(jù)單因素實驗所確定的因素,將乙醇體積分數(shù)、pH值和液料比做3因素3水平正交實驗。因素水平見表1,正交實驗結果見表2,方差分析結果見表3。
表1正交實驗因素與水平
Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment
水平A,乙醇體積分數(shù)/%B,pH值C,液料比/mL·g-115075∶1265810∶1380915∶1
表2正交優(yōu)化實驗結果
Tab.2 Results of the orthogonal experiment
實驗序號ABC提取率/%18085∶185.59280910∶157.90365710∶154.6746595∶1100.78565815∶183.50650915∶114.7575075∶131.82880715∶142.52950810∶137.42K183.99129.01218.19K2238.95206.51144.39K3186.01173.43140.77R154.9677.5077.42
以《中國藥典》2015年版規(guī)定的厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量為指標,進行3水平3因素正交實驗,見表2。由表2可知,乙醇體積分數(shù)對厚樸酚與和厚樸酚的提取率影響最大,其次為pH值,液料比影響最小,見表3。由表3可知,乙醇體積分數(shù)對提取率的影響較為顯著,差異有統(tǒng)計學意義,pH值和液料比影響不明顯。綜合分析,優(yōu)選厚樸酚及和厚樸酚提取的優(yōu)選條件是:A2B2C1,即:pH值為8、乙醇體積分數(shù)為65%、液料比為5∶1、提取次數(shù)為2次。
表3正交實驗方差分析結果
Tab.3 Results of variance analysis of the orthogonal experiment
因素偏差平方和自由度方差F顯著性乙醇體積分數(shù)4135.92522067.96335.489<0.05pH值1008.1862504.0938.651>0.05液料比1192.2342596.11710.230>0.05誤差 116.5402 58.270
2.6正交實驗驗證 以厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的提取率為指標,按照正交優(yōu)選實驗選出的工藝條件:乙醇體積分數(shù)為65%,pH值為8,提取次數(shù)為2次,每次提取時間為0.5 h,液料比為5∶1,進行3次重復實驗,每次實驗的提取液平行取3份樣品,得到平均提取率為94.08%,104.50%和101.73%。結果表明,所選工藝條件厚樸酚與和厚樸酚的提取效率較高且重復性較好。
近年來,厚樸已成為漸危種,優(yōu)質的厚樸藥材越發(fā)珍貴,可見對厚樸中有效成分的提取對于資源保護有重要意義。厚樸酚與和厚樸酚作為厚樸的主要活性成分,在抗癌和抗菌方面效果突出,在臨床上有較為廣闊的應用前景。實驗中用堿性乙醇超聲提取法提取厚樸藥材中的厚樸酚與和厚樸酚,利用超聲的空化效應,使植物細胞壁加速破裂,有利于有效成分的快速溶出。同時結合了厚樸酚與和厚樸酚的結構特點,二者均是酚類物質,呈酸性,在乙醇溶液中加入適量的氫氧化鈉溶液進行調節(jié),使有效成分能更好地溶解在溶液中,進一步提高提取效率。經優(yōu)化后的提取方法操作簡單、提取效率高,可為工業(yè)提取厚樸酚與和厚樸酚提供參考。
本實驗通過單因素水平實驗分析了pH值、乙醇體積分數(shù)、液料比和提取次數(shù)4個因素對厚樸酚與和厚樸酚提取率的影響。依據(jù)單因素實驗所確定的因素,將乙醇體積分數(shù)、pH值和液料比設計3因素3水平正交實驗,進一步優(yōu)化提取條件,為深入開發(fā)和利用厚樸提供理論依據(jù)。厚樸酚與和厚樸酚為同分異構體,其結構、性質類似,但藥理活性不同,因此,將二者從厚樸中提取后,將其進一步分離純化也是非常重要的步驟,在筆者之后的工作中將對其進行研究。
[1] 蘇健,王寶琴.厚樸及其制劑中厚樸酚、和厚樸酚含量測定方法研究綜述[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2002,9(9):35-37.
[2] 閆婕,衛(wèi)瑩芳,胡慧玲,等.全國不同產地厚樸藥材品質評價[J].時珍國醫(yī)國藥,2016,27(2):472-474.
[3] 張丹,顏學偉,曹緯國,等.重慶產厚樸不同部位厚樸酚與和厚樸酚分布規(guī)律的研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2012,29(7):614-617.
[4] 國家藥典委員會.中國藥典:2015年版:一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:251-252.
[5] 張淑潔,鐘凌云.厚樸化學成分及其現(xiàn)代藥理研究進展[J].中藥材,2013,36(5):838-843.
[6] 張勇,唐方.厚樸酚藥理作用的最新研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(23):3526-3530.
[7] 李國章.和厚樸酚的藥理作用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2012,8(1):162-163.
[8] 羅鳳平.厚樸酚及其衍生物的合成、結構與性質的研究[D].無錫:江南大學,2008,13-25.
[9] 孟超,吳豐,馬林.厚樸類中藥厚樸酚及和厚樸酚含量測定[J].天然產物研究與開發(fā),2007,19(4):1024-1026.
[10]楊欣諭,葉瑋.厚樸酚、小檗堿與鋅離子對口臭致病菌的抑菌研究[J].廣東牙病防治,2014,22(3):123-127.
[11]池田浩治.厚樸酚抑制腫瘤細胞增殖[J].國際醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊,2002,24(4):248.
[12]孫亞萍.和厚樸酚對人肺癌A549細胞的抗增殖及誘導凋亡的作用研究[D].杭州:浙江大學,2010:2-4.
[13]陳菲.和厚樸酚多途徑抗腫瘤機制研究[D].杭州:浙江大學,2004:25-37.
[14]徐棟.和厚樸酚逆轉P-gp介導的腫瘤多藥耐藥及協(xié)同、增敏化療藥物殺傷腫瘤細胞的體內外藥效研究[D].杭州:浙江大學,2007:21-29.
[15]王敏,林茂,馬曉莉,等.和厚樸酚對人神經膠質瘤U87細胞的體內外抗腫瘤作用[J].遵義醫(yī)學院學報,2016,39(5):459-463.
[16]董兵輪,叢威亮,李曉明,等.和厚樸酚對人肝癌SMMC-7721細胞體外抗腫瘤活性的研究[J].世界最新醫(yī)學信息文摘,2016,16(65):3-4.
[17]崔帥,張劍,黃建梅,等.和厚樸酚衍生物的合成及其抗焦慮活性研究[J].西北藥學雜志,2015,30(3):279-282.
[18]李治民,王利萍.中藥化學成分提取分離方法的研究觀察[J].中國保健營養(yǎng),2013,(6):3328.
[19]張建超,鄢方兵,蘆金清.超聲提取和索氏提取厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的比較研究[J].湖北中醫(yī)學院學報,2010,12(1):38-40.
[20]姜寧,劉曉鵬.微波輔助提取厚樸中厚樸酚及和厚樸酚的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(11):1012-1015.