劉 睿，陳啟賀，任金威，徐 騰，李 林，杜 倩，烏 蘭，劉欣然，李 勇

(北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，北京 100191)

急性酒精中毒(acute alcoholism，AAI)俗稱醉酒，是指因短時間內攝入過量酒精或酒類飲料引起的中樞神經系統(tǒng)由興奮轉為抑制的狀態(tài)，按程度可分為興奮期、共濟失調期和昏睡期，又可稱為急性乙醇中毒。急性酒精中毒可能造成肝臟、心腦血管等多系統(tǒng)損傷，嚴重者甚至可危及生命。據(jù)統(tǒng)計，急性酒精中毒已成為節(jié)假日里發(fā)病率最高的3種疾病之一，且發(fā)病年齡段多集中在25～45歲，因此尋找方便有效的防治措施有著重要的意義[1-2]。在所有因飲酒導致的疾病中，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)最為常見，ALD指因酒精損傷肝細胞而引起的一系列疾病，臨床常見的有酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。在我國酒精性肝病已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。但目前除控制酒精攝入外尚無ALD特異治療方法，臨床上使用糖皮質激素或丙基硫氧嘧啶治療ALD，但是這些藥物在應用中仍有爭議。急性肝損傷是許多肝臟疾病的初始環(huán)節(jié)和共同途徑，因此通過功能性食品在急性肝損傷早期避免或緩解對肝臟的損害，防治ALD的發(fā)生，成為當今研究的新趨勢[3-6]。

人參在我國已有四千多年的藥用歷史，我國的人參屬五加科、人參屬的多年生草本植物，主要產于吉林省，是聞名遐邇的“東北三寶”之一。研究發(fā)現(xiàn)，人參具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、增強免疫力、改善記憶力等作用[7]，其中人參的抗氧化作用已經在動物實驗和人體研究中得到證實，而關于人參的抗炎作用則報道較少[8-10]。人參低聚肽(ginseng oligopeptides，GOP)是利用生物酶解技術從人參中得到的小分子生物活性肽，主要是由分子量很小但活性很高的短肽分子組成。研究發(fā)現(xiàn)，低聚肽可以有效提高蛋白質的吸收利用率，要比單個氨基酸的吸收更為有效，但現(xiàn)有研究多集中于體外研究，且大部分針對人參蛋白，對其功能研究較少報道[7，11]。

本研究擬采用大鼠急性酒精中毒模型，探討人參低聚肽對急性酒精中毒和早期肝損傷的保護作用，并對其可能的作用機制進行進一步的探索，為人參低聚肽在作為保護機體免受酒精傷害和抗酒精性肝損傷的功能性因子的保健食品及藥品的開發(fā)方面提供實驗研究基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品

人參低聚肽(GOP)，淡黃色固體粉末，由吉林肽谷生物工程有限責任公司提供。GOP是利用生物酶解技術從吉林人參中得到的小分子生物活性肽的混合物，相對分子質量分布為：<180(占71.36%)、180～500(占20.16%)、500～1 000(占5.87%)、1 000～2 000(占1.97%)、>2 000(占0.64%)。質量分數(shù)為95.42%，氨基酸總量占3.94%。乳清蛋白，由北京中柏公司提供，其蛋白含量為78%。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：無水乙醇(分析純)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；乙醇脫氫酶(ADH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)試劑盒，北京安迪華泰科技有限公司。

主要儀器：Adventurer TM通用型分析天平，美國奧豪斯國際貿易有限公司；Eppendorf高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；電熱恒溫水浴鍋，北京天林恒泰科技有限公司；FSH-2A可調高速電動勻漿機，金壇市金南儀器廠；日本奧林巴斯株式會社全自動生化儀AU400，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；352型酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海創(chuàng)奕科教設備有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，適應期結束時，體重200±20g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。飼養(yǎng)地點為北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，動物實行分籠飼養(yǎng)，每籠3只，實驗期間自由飲水、進食。動物飼養(yǎng)實驗室符合國標SPF級，溫度范圍為22±2℃，相對濕度為50%～60%，晝∶夜明暗交替時間為12 h∶12 h。

1.4 實驗方法

1.4.1動物分組及用藥 按體重將實驗動物隨機分為7組，1組為正常對照組，其余6組為模型組：即1個模型對照組、1個乳清蛋白對照組(0.25g/kg BW)和4個人參低聚肽組(0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0g/kg BW，分別對應GOP 1、GOP 2、GOP 3和GOP 4組)。每日經口灌胃給予受試樣品，受試樣品給予時間30d?？瞻讓φ战M和模型對照組給予蒸餾水，乳清蛋白組和人參低聚肽組給予相應濃度受試物，灌胃量為1mL/100g，人參低聚肽和乳清蛋白溶液均用蒸餾水配制。動物每周稱重2次，按體重調整受試樣品劑量。給予受試樣品結束后將模型對照組及各樣品組一次性灌胃給予50%乙醇17.5mL/kg BW(7g/kg BW)，空白對照組給予蒸餾水。實驗期間觀察實驗動物的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、日?；顒忧闆r等。

1.4.2翻正反射 模型組以翻正反射是否消失或恢復為指標觀察大鼠的醉酒與醒酒情況。將大鼠背向下輕置于動物籠內，如果大鼠保持背向下的姿勢30s以上，則認為翻正反射消失，即為醉酒；當翻轉反射消失的大鼠能夠自主從背向下的姿勢翻轉過來時，為翻正反射恢復，即為醒酒。實驗過程中記錄灌酒后翻轉反射消失的動物只數(shù)、翻轉反射消失時間及翻轉反射恢復時間，從翻轉反射消失到翻正反射恢復的這段時間則為翻轉消失持續(xù)時間[12]。

1.4.3乙醇代謝酶檢測 大鼠灌酒后，禁食16h經股動脈采血后處死，分離血清及血漿并留取肝臟，進行各項指標的檢測。在冰浴剝離肝臟，除去脂肪組織，用預冷的生理鹽水漂洗組織至無血色，稱取相同部位組織適量，制成勻漿，3 000r/min低溫離心10min，取上清，檢測肝組織乙醇脫氫酶(ADH)的活性。

1.4.4血生化指標檢測 血液3 000r/min離心10min后，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。

1.4.5炎癥因子水平檢測 血液3 000r/min離心10min后，分離血清，用 ELISA 法檢測血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)水平。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果與分析

2.1 人參低聚肽對SD大鼠翻正反射的影響

給予受試樣品的30d內，各組大鼠的毛色、精神狀態(tài)和糞便等均正常，無明顯的差異。酒精灌胃后模型對照組大鼠出現(xiàn)了明顯的酒精中毒現(xiàn)象，如反應遲鈍、嗜睡、活動減少、精神萎靡，有些大鼠表現(xiàn)極度活躍、狂躁，隨后轉為安靜狀態(tài)、嗜睡、精神萎靡等；人參低聚肽干預組大鼠精神狀態(tài)明顯較模型對照組好，在高劑量組表現(xiàn)得尤為明顯。由表1可知，實驗各組體重無明顯差異(P>0.05)。與模型對照組相比，人參低聚肽干預組大鼠翻正反射消失只數(shù)減少，翻正反射消失的比率明顯降低，GOP 4組與模型對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。人參低聚肽干預組翻正反射消失的時間明顯長于模型對照組，恢復時間明顯短于模型對照組。

表1 人參低聚肽對SD大鼠翻正反射的影響(n=10)

注：**與模型對照組相比，P<0.01

2.2 人參低聚肽對SD大鼠血清生化指標的影響

血清ALT、AST水平是評價早期肝損傷的常用指標。由表2可知，模型對照組大鼠血清ALT、AST較空白對照組明顯升高(P<0.05)，人參低聚肽各組血清ALT、AST含量較模型對照組則顯著降低(P<0.05)，人參低聚肽各組與乳清蛋白組相比無明顯差異(P>0.05)。

與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清TC、HDL-C、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，血清TG含量明顯升高(P<0.05)；與模型對照組相比，人參低聚肽各組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量與模型對照組均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與乳清蛋白組相比，人參低聚肽各組TG含量顯著降低(P<0.05)，其余指標與乳清蛋白組相比無明顯差異(P>0.05)。

2.3 人參低聚肽對SD大鼠肝組織乙醇代謝酶的影響

如附圖所示，與空白對照組相比，模型對照組大鼠肝臟ADH含量明顯降低，人參低聚肽組除GOP1組外，其他3組大鼠ADH含量均較空白對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型對照組相比，人參低聚肽各組ADH含量平均值均高于模型對照組，其中GOP2、GOP3和GOP4組與模型對照組相比，差異具有顯著性(P<0.05)；與乳清蛋白對照組相比，除GOP1組ADH含量降低外，其他3組ADH含量均明顯升高(P<0.05)。在人參低聚肽各劑量組，GOP1、GOP2、GOP3組隨著劑量的增加，大鼠ADH含量也明顯增加，在GOP3組(劑量為0.25g/kgBW時)達到最高值，GOP4組ADH含量較GOP3組降低，但仍高于GOP1和GOP2組。

表2 人參低聚肽對SD大鼠血清生化指標的影響

注：a與空白對照組相比，P<0.05；a*與空白對照組相比，P<0.001；b與模型對照組相比，P<0.05；b*與模型對照組相比，P<0.001；c與乳清蛋白組相比，P<0.05；c*與乳清蛋白組相比，P<0.001

附圖 人參低聚肽對SD大鼠肝臟ADH含量的影響注：a與空白對照組相比，P<0.05；a*與空白對照組相比，P<0.001；b與模型對照組相比，P<0.05；b*與模型對照組相比，P<0.001；c與乳清蛋白對照組相比，P<0.05；c*與乳清蛋白對照組相比，P<0.001

2.4 人參低聚肽對SD大鼠血清炎癥因子水平的影響

SD大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平如表3所示，與空白對照組相比，模型對照組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.001)，人參低聚肽各組除血清TNF-α水平較空白對照組高外，血清IL-1β和IL-6水平均低于空白對照組，差異具有顯著性(P<0.001)；與模型對照組和乳清蛋白對照組相比，人參低聚肽4個干預組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

動物實驗是目前研究急性酒精中毒最常用的方法，但尚無統(tǒng)一的動物醉酒模型。結合國內外以往報道，應保證在實驗動物可以承受的范圍內，盡量加大灌胃酒精劑量，以觀察動物急性酒精中毒的表現(xiàn)。本研究在總結以往研究經驗基礎上，通過預實驗的觀察探討，實驗時按照50%乙醇17.5mL/kg BW(7g/kg BW)的劑量灌胃，造成SD大鼠急性酒精中毒模型。單純的蛋白質攝入增加可能會對脂代謝指標有一定的影響，因此本研究設置了乳清蛋白組作為對照來排除因單純提高蛋白質的攝入量而引起的假陽性結果。乳清蛋白在消化過程中可產生多種生物活性多肽，研究證實其具有提高免疫力、抗疲勞、抗氧化、降血脂等多種功效[13-14]。

表3 人參低聚肽對SD大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

注：a與空白對照組相比，P<0.05；a*與空白對照組相比，P<0.001；b與模型對照組相比，P<0.05；b*與模型對照組相比，P<0.001；c與乳清蛋白組相比，P<0.05；c*與乳清蛋白組相比，P<0.001

急性酒精中毒分為興奮期、共濟失調期和昏睡期三個階段，其中昏睡期最容易發(fā)生危險，也是最能檢驗解酒藥物是否有效的時期。翻正反射消失表明大鼠開始進入昏睡期，因此國內外研究均把翻正反射消失作為評價醉酒的首要方法[15-16]。在本研究中，給予動物酒精灌胃后，模型對照組有70%的動物都陷入了昏睡期，人參低聚肽干預后組陷入昏睡期的老鼠明顯減少，GOP4組僅有1只陷入昏睡期，且較模型對照組明顯延遲了醉酒時間，提前了醒酒時間，表明長期服用吉林人參低聚肽能減少醉酒的機率，縮短醉酒時間。

當肝細胞受損時，血清中ALT和AST含量將明顯升高[17]。由結果可知，與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.05)，說明模型對照組出現(xiàn)了急性肝損傷；而GOP干預能夠顯著降低大鼠血清 ALT、AST水平((P<0.05或P<0.01)，說明人參低聚肽對酒精誘導的大鼠急性肝損傷有保護作用。酒精性肝病患者中脂類代謝異常十分常見，大量乙醇在體內的脫氫氧化會導致三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱，并降低肝臟運出脂肪的能力，從而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細胞內沉積[4，18-19]。本研究中模型對照組大鼠血清TG含量較空白對照組顯著升高(P<0.05)，說明酒精攝入造成了大鼠甘油三酯水平的增高，但人參低聚肽各組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量與模型對照組相比均無明顯變化(P>0.05)，因此尚不能認為人參低聚肽可以有效地預防酒精引起的體內血脂水平的升高，還需進一步研究證實。

機體攝入的酒精90%在肝臟代謝，首先由肝細胞內的乙醇脫氫酶(ADH)氧化為乙醛，再由乙醛氧化為乙酸，乙酸進一步分解為水和二氧化碳排出體外。乙醛不但可直接損失肝細胞、抑制三羧酸循環(huán)、引起脂質過氧化反應，還可抑制細胞的分化及損傷組織的再生與修復，促進肝纖維化的形成[4，20]。本研究結果表明，人參低聚肽干預組ADH活性顯著高于模型對照組(P<0.05)，GOP2、GOP3和GOP4 三組大鼠ADH含量均高于空白對照組和乳清蛋白對照組(P<0.05)，此外，在4個人參低聚肽劑量組中，GOP3組(即0.25g/kg BW劑量組)ADH含量明顯干預其他3組。這表明人參低聚肽干預加快了乙醇的氧化，從而減輕了酒精代謝產物乙醛對機體的急性損害，且0.25g/kgBW劑量的人參低聚肽可能更有利于提高肝臟乙醇代謝酶的活性，但還需進一步進行驗證。

炎癥反應是酒精性肝炎的主要特征之一。酒精攝入可引起調節(jié)炎癥反應相關的許多基因表達，導致炎性因子合成、釋放，使炎癥細胞對炎癥刺激過度反應產生大量的炎癥介質如TNF-α、IL-1β和IL-6等，其中TNF-α是ALD發(fā)生發(fā)展過程中重要的促炎因子，與炎癥反應、脂質代謝和細胞死亡都密切相關[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，人參低聚肽能夠明顯降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平(P<0.05)，因此可以推斷人參低聚肽可在一定程度上改善酒精引起的血清炎癥反應。

綜上所述，本研究通過建立大鼠急性酒精中毒模型，設立空白對照組、模型對照組和乳清蛋白組作為對照組，探討人參低聚肽對急性酒精中毒的保護作用及其可能機制。研究表明，人參低聚肽可有效降低醉酒大鼠翻正反射消失的比率，降低酒精引起的血清ALT、AST的升高，提高肝臟乙醇脫氫酶活性，抑制酒精導致的血清炎癥因子水平的升高，從而起到保護肝細胞與改善肝功能的作用，這對早期防治酒精性肝病和保護機體免受急性酒精中毒的傷害有重要意義。

但是仍有許多問題有待進一步探討。其一，動物模型目前并沒有統(tǒng)一定論，干預方式各不相同，最終模型可能涉及酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等，動物模型并不穩(wěn)定，因此需要尋找適宜的動物模型來研究功能性食品對急性酒精中毒的防治作用有著重要的意義；其二，目前關于人參低聚肽的研究相對較少，本研究表明，人參低聚肽具有提高性功能、抗疲勞、增強機體免疫力[7]等作用。根據(jù)目前的研究結果，筆者會繼續(xù)優(yōu)化劑量設置，進行更深入的研究，如在體外實驗中進一步驗證人參低聚肽對酒精性肝損傷的保護作用機制。此外，也需要人群研究進一步證實其對酒精性肝損傷的改善效果及適宜劑量。◇

[1]王艷艷.七味姜黃方對小鼠急性酒精中毒的干預研究[D].成都中醫(yī)藥大學，2012.

[2]Lee S，Guo WJ，Tsang A，et al.Associations of cohort and socio-demographic correlates with transitions from alcohol use to disorders and remission in metropolitan China[J].Addiction，2009，104(8)：1313-1323.

[3]中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.酒精性肝病診療指南(2010年修訂版)[J].中華肝臟病雜志，2010，18(3)：167-170.

[4]劉玉蘭.整合肝腸病學[M].人民衛(wèi)生出版社，2014.

[5]Powers MS，Chester JA.Effects of stress，acute alcohol treatment，or both on pre-pulse inhibition in high-and low-alcohol preferring mice[J].Alcohol，2014，48(2)：113-122.

[6]蔡夏夏，鮑雷，王楠，等.膳食5’-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響[J].食品科學，2015，36(15)：212-216.

[7]何麗霞，劉睿，任金威，等.吉林人參低聚肽的免疫調節(jié)作用[J].科技導報，2015，33(18)：62-67.

[8]Mahdy Hassanzadeh D，Hedayatollah F，Morteza M，et al.The effects of panax ginseng on lipid profile，pro-oxidant：antioxidant status and high-sensitivity C reactive protein levels in hyperlipidemic patients in Iran[J].International Journal of Preventive Medicine，2013，4(9)：1045-1051.

[9]Demir I，Kiymaz N，Gudu BO，et al.Study of the neuroprotective effect of ginseng on superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)levels in experimental diffuse head trauma[J].Acta Neurochirurgica，2013，155(5)：913-922.

[10]Hyeong-Geug K，Sa-Ra Y，Hye-Jung P，et al.Antioxidant effects of Panax ginseng C.A.Meyer in healthy subjects：a randomized，placebo-controlled clinical trial.[J].Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association，2011，49(9)：2229-2235.

[11]李勇.肽臨床營養(yǎng)學[M].北京大學醫(yī)學出版社，2012.

[12]林兵，于永超，陳禹，等.玉米肽對急性酒精中毒大鼠的作用研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2014，20(4)：66-68.

[13]Powers MS，Chester JA.Effects of stress，acute alcohol treatment，or both on pre-pulse inhibition in high-and low-alcohol preferring mice[J].Alcohol，2014，48(2)：113-122.

[14]蒲玲玲，郭長江.乳清蛋白的組成及其主要保健功能[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17(6)：68-70.

[15]Van Skike CE，Botta P，Chin VS，et al.Behavioral effects of ethanol in cerebellum are age dependent：potential system and molecular mechanisms[J].Alcohol Clin Exp Res，2010，34(12)：2070-2080.

[16]Liang J，Li Q，Lin B，et al.Comparative studies of oral administration of marine collagen peptides from Chum Salmon(Oncorhynchus keta)pre-and post-acute ethanol intoxication in female Sprague-Dawley rats[J].Food Funct，2014，5(9)：2078-2085.

[17]Jayakumar T，Ramesh E，Geraldine P.Antioxidant activity of the oyster mushroom，pleurotus ostreatus，on CCl 4-induced liver injury in rats[J].Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association，2006，44(12)：1989-1996.

[18]Abid R，Mahmood R，Santosh K H.Hypolipidemic and antioxidant effects of ethanol extract of Cassia fistula fruit in hyperlipidemic mice[J].Pharm Biol，2016：1-8.

[19]沈峰.FibroScan聯(lián)合CK-18評估脂肪性肝病的全國多中心臨床研究[D].上海交通大學，2014.

[20]卿篤信.酒精代謝酶與酒精性肝病的關系研究進展[J].國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊)，2003，23(3)：310-313.

[21]Hoek JB，Pastorino JG.Ethanol，oxidative stress，and cytokine-induced liver cell injury[J].Alcohol，2002，27(1)：63-68.

[22]Kiyoshi T，Shizuo A.TLR signaling pathways[J].Seminars in Immunology，2004，16(1)：3-9.

[23]Egan LJ，Lars E，Greten FR，et al.IκB-kinaseβ-dependent NF-κB activation provides radioprotection to the intestinal epithelium[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101(8)：2452-2457.

[24]林兵，于永超，陳禹，等.膠原多肽對亞急性酒精中毒大鼠的保護作用研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2015，21(2)：69-72.