王清萍，張士發(fā)

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 兒科，安徽 蕪湖 241001)

隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展及新生兒重癥監(jiān)護(hù)(neonatal intensive care unit，NICU)技術(shù)的不斷提高，早產(chǎn)兒的出生率和存活率越來越高，導(dǎo)致早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1](認(rèn)知、行為障礙、視聽功能異常和腦癱)發(fā)病率逐年增加，從而影響早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量，給家庭社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。

早產(chǎn)兒和低出生體質(zhì)量兒腦損傷主要原因是早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷(white matter damage，WMD)[2]。腦白質(zhì)主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突共同組成。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocytes precursor cells，OPCs)對缺氧、炎性介質(zhì)、谷氨酸毒性等多種損傷較其他階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞敏感，所以O(shè)PCs是早產(chǎn)兒WMD的關(guān)鍵性靶細(xì)胞。在細(xì)菌感染時，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)與小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)上的特異性受體TLRs結(jié)合，使其激活，被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量腫瘤壞死因子α(tumor necronecrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、活性氮(reactive nitrogen species，RNS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、NO等免疫應(yīng)答分子，直接損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞特別是OPCs[3]，使腦白質(zhì)髓鞘化受損，最終髓鞘發(fā)育不良。Nogo-A是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中發(fā)現(xiàn)的一種抑制軸突生長的蛋白，與其受體復(fù)合體NgR結(jié)合，將信號傳入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Rho/Rho激酶的活化，調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡/壞死。最近研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A和NgR還存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段的神經(jīng)前體細(xì)胞中，對神經(jīng)前體細(xì)胞分化和神經(jīng)突觸生長及可塑性變化具有調(diào)控作用[5]。感染是否影響MG和OPCs上的NgR表達(dá)及炎癥因子的釋放從而引起腦白質(zhì)的損傷，目前機(jī)制尚不明確。本實驗采用細(xì)胞體外培養(yǎng)，應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)，觀察NgR在MG和OPCs的表達(dá)情況及TLR-4在MG的表達(dá)情況，并監(jiān)測相關(guān)炎癥因子，初步探討NgR的表達(dá)在TLR-4介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康5月齡SD孕鼠，SPF級，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物自由進(jìn)食水。實驗主要試劑CD11b-FITC(Biolegend)，O4-PE(美國R&D公司)，脂多糖(LPS,Biosharp)，TLR4抑制劑TAK-242(日本Takeda制藥有限公司)，RNA抽提試劑(Trizol)(Takara公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 早產(chǎn)SD大鼠OPCs和MG的分離培養(yǎng)和鑒定 取孕16～17 d的SD大鼠，在頸部皮下注射米非司酮150 μg/只誘導(dǎo)早產(chǎn)，在孕22 d前出生大鼠為早產(chǎn)鼠，在無菌條件下取早產(chǎn)SD大鼠腦皮質(zhì)，再采用振蕩法結(jié)合差速貼壁法獲取OPCs和MG。分別用特異性抗體CD11b和O4對MG和OPCs進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定。

1.2.2 特異性NgR shRNA慢病毒感染MG和OPCs 將(1～2)×105個細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)1 d后將1 mL的病毒液加入到6孔板中，輕柔混勻，加入6～8 μL Polybrene。培養(yǎng)基和病毒等試劑充分混勻后，把細(xì)胞板放回培養(yǎng)箱孵育。培養(yǎng)6～8 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，加入1 mL的新鮮培養(yǎng)基。感染24 h后更換新鮮的培養(yǎng)基。

1.2.3 共同培養(yǎng)、分組和誘導(dǎo) 取培養(yǎng)2 d的MG和OPCs，在Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行共培養(yǎng)，將MG加入Transwell上室，OPCs加入下室。分別在Transwell下室內(nèi)加入無血清化學(xué)條件培養(yǎng)基進(jìn)行孵育(無血清培養(yǎng)基含有胰島素、去鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、bFGF、PDGF)。分組：第1組：OPCs單獨培養(yǎng)對照組。在培養(yǎng)板的每孔加入與對照組LPS等量的DMEM/F12培養(yǎng)液；第2組：OPCs單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組。在培養(yǎng)板的每個孔中加入脂多糖100 μg/L；第3組：MG和OPCs共同培養(yǎng)對照組。在Transwell上室內(nèi)加入和對照組LPS等量的DMEM/F12培養(yǎng)液；第4組：MG和OPCs共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組。在Transwell上室內(nèi)加入脂多糖100 μg/L；第5組：OPCs和MG共同培養(yǎng)加TLR-4抑制劑誘導(dǎo)組。先在上室中加入100 μg/L的TAK-242，24 h后再加入脂多糖100 μg/L；第6組：NgRShRNA轉(zhuǎn)染OPCs共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組。將慢病毒轉(zhuǎn)染的OPCs細(xì)胞置于Transwell下室，MG置于上室共同培養(yǎng)，在上室內(nèi)加入脂多糖100 μg/L；第7組：NgRShRNA轉(zhuǎn)染MG單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組。將慢病毒轉(zhuǎn)染的MG細(xì)胞培養(yǎng)液中加入脂多糖100 μg/L。加入LPS孵育48 h后，分別收集各組培養(yǎng)液上清和細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測OPCs、MG的NgR和MG的TLR-4基因的表達(dá)情況 均由上海捷瑞生物工程有限公司合成熒光定量PCR需要的NgR、TLR-4上下游引物。同時合成內(nèi)參基因GAPDH序列上下游引物NgR Forward：5′-CGCATCTCTTTCTGCATGGC-3′,Reverse：5′-GTGCAAGAGGAGACGGTCAA-3′,TLR-4 Forward：5′-GCTGGTTGCAGAAAATGCCA-3′,Reverse：5′-AGGA GTACCTCTATGCAGGG-3′,GAPDH Forward：5′-ACTTTGGCATCGTGGAAGGG-3′，Reverse：5′-ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG-3′。①細(xì)胞總RNA的提?。喊碦NA提取試劑說明書操作，Trizol提取總RNA，所提取RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之間。②RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和程序：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL+Total RNA 3 μL+RNase Freed H2O 7 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85 ℃，5 s(逆轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。③聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)12.5 μL +PCR Forward Primer(10 μmol/L)1 μL+PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL+DNA 模板2 μL+ddH2O 8.5 μL，預(yù)變性(重復(fù)1次：95 ℃，30 s)；退火：PCR反應(yīng)(重復(fù)40次，95 ℃，5 s；60 ℃，30 s)；溶解。用real-time PCR儀(ABI Step One Plus real-time PCR，Bio-Rad)獲得目的基因和內(nèi)參基因Ct值。④實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以2-ΔΔct值反映目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α含量 培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，收集上清。按照試劑盒說明書操作步驟檢測細(xì)胞分泌TNF-α的含量。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光法觀察早產(chǎn)SD大鼠的MG和OPCs 在倒置顯微鏡下觀察純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞，呈多態(tài)性，其中以圓形、分枝狀多見(如圖1)。觀察純化后的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體，培養(yǎng)12 h左右細(xì)胞就開始貼壁生長，培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞胞體呈小圓形，有兩個或三個突起(如圖2)。

圖1 CD11b-FITC免疫熒光染色陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞

圖2 O4-PE免疫熒光染色陽性的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

2.2 脂多糖刺激和慢病毒干擾后MG的TLR-4 mRNA的表達(dá)情況 結(jié)果顯示第4組MG的TLR-4 mRNA的表達(dá)水平高于第3、5、7組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第7組與第3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 各組中MG的TLR-4基因mRNA的表達(dá)強度比較

組別MG的TLR-4mRNA表達(dá)強度OPCs和MG共同對照組0．4005±0．2384aOPCs和MG共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組1．2010±0．3553bOPCs和MG共同培養(yǎng)加TLR?4抑制劑誘導(dǎo)組0．1023±0．4543cNgRShRNA轉(zhuǎn)染MG單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組0．4896±0．2006aF11．54P0．03

相同字母組之間比較P>0.05；不同字母組之間比較P<0.05。

2.3 各組TNF-α的含量情況 結(jié)果顯示第4組TNF-α的釋放量高于其他6組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 各組中TNF-α含量的比較 pg/mL

相同字母組之間比較P>0.05；不同字母組之間比較P<0.05。

2.4 脂多糖刺激和慢病毒干擾后小膠質(zhì)細(xì)胞的NgR mRNA的表達(dá)情況 結(jié)果顯示第4組MG的NgR mRNA的表達(dá)水平低于第3、5、7組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第7組與第3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 各組中MG的NgR基因mRNA的表達(dá)強度比較

組別MG的NgRmRNA的表達(dá)強度OPCs和MG共同培養(yǎng)組0．1048±0．0305aOPCs和MG共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組1．0758±0．1859bOPCs和MG共同培養(yǎng)加TLR?4抑制劑誘導(dǎo)組0．4195±0．1121cNgRShRNA轉(zhuǎn)染MG單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組0．1145±0．0441aF47．01P0．00

相同字母組之間比較P>0.05；不同字母組之間比較P<0.05。

2.5 脂多糖刺激和慢病毒干擾后少突膠質(zhì)細(xì)胞前體的NgR mRNA的表達(dá)情況 結(jié)果顯示第2、4、5組OPCs的NgR mRNA的表達(dá)水平高于第1、3、6組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 各組中OPCs的NgR基因mRNA的表達(dá)強度比較

組別OPCs的NgRmRNA的表達(dá)強度OPCs單獨培養(yǎng)對照組1．0243±0．2729aOPCs單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組3．2343±0．4183bOPCs和MG共同培養(yǎng)對照組0．4053±0．1253cOPCs和MG共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組10．9138±0．3910dOPCs和MG共同培養(yǎng)加TLR?4抑制劑誘導(dǎo)組3．8903±0．4886eNgRShRNA轉(zhuǎn)染OPCs共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組0．7659±0．2766aF393．03P0．00

相同字母組之間比較P>0.05；不同字母組之間比較P<0.05。

3 討論

近年來大量實驗研究表明宮內(nèi)感染是早產(chǎn)兒腦損傷的重要原因[6]，宮內(nèi)感染引起的早產(chǎn)兒腦損傷可能與多種細(xì)胞因子增多有關(guān)。LSP可被MG/巨噬細(xì)胞表面的TLRs識別，激活TLR4-NF-κB通路從而引起炎癥介質(zhì)(如TNF-a)的上調(diào)，并釋放、分泌一系列免疫應(yīng)答分子、神經(jīng)毒性物質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，對腦損傷有重要的作用[7-8]。TNF-a是炎性反應(yīng)的主要因子，也可以引起其他大多細(xì)胞因子的釋放，并可抑制OPCs的分化成熟，還可以誘導(dǎo)凋亡最后引起髓鞘損害和軸突病變，從而導(dǎo)致早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷[9]。

本實驗結(jié)果顯示，LPS刺激MG后，MG的TLR-4 mRNA表達(dá)量和TNF-α釋放量增高，并高于OPCs和MG共同對照組及TLR-4抑制劑處理組。證明TLR-4作為脂多糖的特異性受體，參與了LPS激活MG活化并釋放TNF-α的過程，TLR-4抑制劑可以減輕MG的炎癥反應(yīng)及對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。NgRshRNA轉(zhuǎn)染MG單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組MG的TLR-4 mRNA表達(dá)量低于共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組，但和共同培養(yǎng)對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明脂多糖誘導(dǎo)MG表達(dá)大量TLR-4的需要NgR的介導(dǎo)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

研究表明NgR還表達(dá)于CNS中活化的MG和巨噬細(xì)胞中，調(diào)節(jié)這些吞噬細(xì)胞的運動[10]，這說明NgR在神經(jīng)炎癥性反應(yīng)中也起一定的作用。國內(nèi)外關(guān)于腦白質(zhì)OPCs及MG表達(dá)NgR的文獻(xiàn)極少，目前沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)NgR與細(xì)胞炎性因子之間的關(guān)系的報道和研究。唐軍等[11]通過體外培養(yǎng)OPCs，發(fā)現(xiàn)OPCs在缺氧缺血造模后10 min，NgR的表達(dá)量較正常時增高，并隨著缺氧缺血時間的延長，NgR的表達(dá)量進(jìn)行性增高。

本實驗結(jié)果顯示MG經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，MG上的NgR的mRNA和釋放的TNF-α較共同對照組增高；TLR-4抑制劑處理組MG的NgR的mRNA的表達(dá)量和釋放的TNF-α較OPCs和MG共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組減少；提示TLR-4可能存在上調(diào)NgR基因表達(dá)的作用，具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。NgR特異性ShRAN轉(zhuǎn)染MG單獨培養(yǎng)誘導(dǎo)組，MG的NgR的表達(dá)和共同對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，此組釋放的TNF-α較共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組減少，但沒有TLR-4抑制劑處理組降低明顯。提示MG的NgR參與了調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子TNF-α的釋放。

本實驗結(jié)果顯示OPCs單獨培養(yǎng)組經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞上的NgR的mRNA較單獨對照組增高，但TNF-α差異無統(tǒng)計學(xué)意義。NgR特異性ShRAN轉(zhuǎn)染OPCs共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組，OPCs的NgR較共同培養(yǎng)對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但TNF-α釋放量較OPCs和MG共同培養(yǎng)誘導(dǎo)組減低，說明OPCs不是免疫細(xì)胞，故OPCs不能釋放炎性細(xì)胞因子，但OPCs的NgR參與了MG釋放TNF-α的調(diào)節(jié)。

通過細(xì)菌感染致腦白質(zhì)損傷實驗性研究的進(jìn)一步深入，可以為今后國內(nèi)外腦白質(zhì)損傷及后遺癥的病因研究提供新的思路,并為預(yù)防、治療腦白質(zhì)損傷提供新的有效的解決方法，從而減少早產(chǎn)兒的病死率及殘疾患兒的出生率,減輕社會及家庭的負(fù)擔(dān)。

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