陳倩倩，邊傳紅，康業(yè)斌，趙世民，李淑君

1 河南科技大學(xué)林學(xué)院，洛陽(yáng) 471023；

2 河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司，洛陽(yáng) 471023；

3 河南省農(nóng)科院許昌煙草研究所，許昌 461000

煙草疫霉（Phytophthora parasitica）引起的黑脛病、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）引起的煙草猝倒病、鐮刀菌（Fusariumspp.）引起的根腐病等是世界性土傳病害，常發(fā)生混合侵染，給我國(guó)煙草生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。目前防治煙草土傳病害主要采用化學(xué)防治、抗病育種、栽培管理等措施；然而，煙草高抗品種的缺乏以及長(zhǎng)期施用化學(xué)農(nóng)藥所帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題不容忽視[4-5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者相繼開(kāi)展了應(yīng)用拮抗放線菌防治煙草病害的研究。Lukic A等[6]從煙田中分離出28株放線菌，其中兩株白色鏈霉菌(Streptomyces albus)對(duì)12種煙草病原真菌均有拮抗作用。Kortemaa等[7]報(bào)道了應(yīng)用放線菌的活體制劑Mycostop防治腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌和絲核菌等引起的土傳病害。Loqman等[8]從摩洛哥葡萄根際土壤中分離獲得142株放線菌，其中24株放線菌至少拮抗尖孢鐮刀菌、終極腐霉、大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌及白絹病菌中的4種病原菌。陸錚錚等[9]從煙草根圍土壤中分離篩選出3株對(duì)煙草青枯勞爾氏菌拮抗作用較強(qiáng)的放線菌。隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)境和消費(fèi)品安全性的日漸重視，篩選優(yōu)勢(shì)拮抗微生物對(duì)煙草病害進(jìn)行綠色防控已成趨勢(shì)[10]。本研究從洛陽(yáng)地區(qū)煙草根際土壤中分離、篩選、鑒定出對(duì)煙草主要土傳病原真菌抑制作用較強(qiáng)的放線菌菌株，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)防治煙草土傳真菌病害的生物制劑提供資源。

1 材料與方法

1.1 土壤、菌株及培養(yǎng)基

土壤樣品：采集自河南省洛陽(yáng)市嵩縣田湖鎮(zhèn)南安村，地理位置為N34°28′55″，E112°00′55″，H 340 m。紅黏土，煙草連作2年。

供試病原菌：煙草疫霉（Phytophthora parasitica）、瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）均由河南科技大學(xué)植物病害分子鑒定與綠色防控實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：放線菌的分離培養(yǎng)用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，放線菌的發(fā)酵液制備用大豆酵母培養(yǎng)基，拮抗放線菌的培養(yǎng)性狀觀察用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基以及天門冬素瓊脂培養(yǎng)基。放線菌的拮抗活性測(cè)定與供試病原菌的培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 根際土樣采集

在煙草收獲期，隨機(jī)選取20株健壯烤煙，用鐵鏟去掉煙株一側(cè)0～5 cm的表土，將煙株根系用鐵鏟挖出，用小刀將距根2 mm以上的土壤輕輕剝離，抖落其余土壤并用小毛刷將不能抖落的粘附在根上的土輕輕刷下，作為根際土樣一并收集。采回的土樣室內(nèi)風(fēng)干，經(jīng)研缽研磨后過(guò)2 mm孔徑的篩子（10目）。

1.2.2 土壤放線菌分離與純化

土壤放線菌的分離采用涂布平板法[11-12]。將采集的土樣制成不同稀釋倍數(shù)的土壤懸浮液，涂布到含有3% K2Cr2O7抑制劑的高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，然后將平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。待菌落長(zhǎng)出，選擇放線菌單菌落相對(duì)分散、均勻的平板，其所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最適稀釋倍數(shù)。挑取平板中形態(tài)與顏色不同的單菌落繼續(xù)進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.3 拮抗放線菌的初篩

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[13]。選取在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d的放線菌單菌落，用直徑為5 mm的打孔器打取菌餅，在距PDA平板中央2.5 cm的4點(diǎn)對(duì)稱放置放線菌菌餅，待放線菌培養(yǎng)3 d后，在平板中央接病原菌菌餅，以只接病原菌為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)；于28℃溫箱培養(yǎng)5～7 d后，觀察抑菌帶，并測(cè)量其大小，計(jì)算抑菌帶平均值及抑菌率，初步篩選出對(duì)病原菌具有拮抗作用的菌株。

抑菌率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]×100%

1.2.4 拮抗放線菌的復(fù)篩

將初選獲得的放線菌單菌落轉(zhuǎn)接于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅5-6個(gè)，接入裝有制備100 mL大豆酵母培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃，150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)3d，發(fā)酵液在6000 r/min離心15 min，取上清液，分別用直徑 0.45 μm 、0.22 μm 的細(xì)菌濾器除菌后得到無(wú)菌發(fā)酵液備用；將發(fā)酵液以1%的比例混入PDA（約45℃）培養(yǎng)基，于平板中央接種病原菌菌餅。以加入離心后的無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)液為對(duì)照處理。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)3d后，用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.5 拮抗放線菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將復(fù)選獲得的放線菌菌株接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，用插片法插片，置于恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)7～10 d后取出，用結(jié)晶紫草酸銨染色法染色，在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察菌株氣生菌絲及孢子鏈特征。

將菌株接種在高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、PDA、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基以及天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上，觀察記錄菌株在各種培養(yǎng)基上的氣生菌絲顏色、基內(nèi)菌絲顏色、可溶性色素的顏色和生長(zhǎng)狀況[14]。

1.2.6 拮抗放線菌的生理生化鑒定

對(duì)菌株進(jìn)行明膠液化、淀粉水解、纖維素分解、牛奶的凝固與胨化、碳源利用、氮源利用、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)，測(cè)定其生理生化特性[15]。

1.2.7 拮抗放線菌的分子鑒定

利用通用引物27F：5，-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3，，1492r：5，-GGTTACCTTG TTACGACTT-3，對(duì)菌株16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：模板DNA 2.0 μL，2×Taq PCR Mix 12.0 μL，引物 27F/1492r (10.0 μmol/mL)各1.0 μL，ddH2O 9.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，在紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有效性。檢測(cè)到合適的條帶后，將其所對(duì)應(yīng)的原始擴(kuò)增產(chǎn)物（未純化）100 μL寄往生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用 BLAST 程序與GenBank已登記的基因序列進(jìn)行同源性比較，選取目標(biāo)序列及其同源性高的序列，采用MEGA.6軟件的鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[16]。

2 結(jié)果

2.1 放線菌的分離及拮抗放線菌菌株的初篩

試驗(yàn)從煙田根際土壤樣品中分離純化得到108個(gè)放線菌單菌落。平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)煙草疫霉具有抑菌活性的有19株；對(duì)瓜果腐霉具有抑菌活性的有15株；對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑菌活性的有8株。其中，5株放線菌SA20、SA30、SA57、SA74、SA77對(duì)煙草疫霉抑菌帶≥10 mm，抑菌率≥60%；6株放線菌SA18、SA20、SA27、SA51、SA57、SA74對(duì)瓜果腐霉抑菌帶≥5 mm，抑菌率≥50%；2株放線菌SA17、SA74 對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌帶≥10 mm，抑菌率大于50%（表1、圖1）。

表1 拮抗放線菌對(duì)煙草病原真菌的拮抗作用Tab.1 Antagonistic effect of antagonistic actinomyces against pathogenic fungus

圖1 菌株SA74對(duì)病原真菌的拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of strain SA74 against pathogenic fungus

2.2 拮抗放線菌發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SA74、SA57對(duì)煙草疫霉和瓜果腐霉的抑菌率均大于70%；且菌株SA74對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率也大于50%（表2）。

表2 拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)病原真菌的拮抗作用Tab.2 Antagonistic effect of antagonistic actinomyces against pathogenic fungus

2.3 菌株SA74的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株SA74在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲紅色，疏松、多分枝；氣生菌絲乳白色。光學(xué)顯微鏡下觀察孢子絲螺旋形、略彎曲；孢子短桿狀；孢囊間生或頂生，橢圓形至近圓形；可溶性色素橙紅色。在淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲紫紅色，氣生菌絲白色，可溶性色素淡黃色；在克氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲橘紅色，氣生菌絲白色，無(wú)可溶性色素；在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲深紅色，氣生菌絲白色至橘粉色，可溶性色素淺黃色；在葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲橘黃色，無(wú)氣生菌絲，無(wú)可溶性色素；在天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲紅色，氣生菌絲白色，可溶性色素淺黃色；在蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上基內(nèi)菌絲橘紅色，無(wú)氣生菌絲，無(wú)可溶性色素（圖2）。

圖2 菌株SA74的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain SA74

2.3.2 生理生化鑒定

菌株SA74為革蘭氏陽(yáng)性菌；能使明膠液化，說(shuō)明可產(chǎn)生蛋白酶；可分解利用纖維素且生長(zhǎng)良好，表明可產(chǎn)生纖維素酶；淀粉水解能力較強(qiáng)；可產(chǎn)生硫化氫；不能使牛奶凝固和胨化（圖3）。碳氮源利用情況見(jiàn)表3。

表3 菌株SA74碳氮源利用測(cè)定Tab.3 Carbon and nitrogen source utilization of strain SA74

通過(guò)對(duì)菌株SA74的形態(tài)、培養(yǎng)特征和生理生化特性進(jìn)行試驗(yàn)觀察，初步將其鑒定為鏈霉菌輪生Verticillatus類群。

圖3 菌株SA74的生理生化反應(yīng)Fig.3 Physiological and biochemical reaction of strain SA74

2.3.3 分子鑒定

菌株SA74的16S rDNA序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，所得基因登錄號(hào)為KU870786。將菌株SA74及其同源性高的以及相近種屬的其他放線菌16S rDNA 序列比對(duì)后，利用MEGA.6軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明菌株SA74的16S rDNA 序列與GenBank 登錄號(hào)為AY999774（Streptomyces aureoverticillatus）等序列同源性大于98%。

圖4 菌株SA74 16Sr DNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain SA74 based on 16Sr DNA gene sequence

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，將SA74菌株鑒定為金黃垂直鏈霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）。依據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)，其分類地位屬放線菌門、放線菌綱、放線菌目、鏈霉菌屬、金黃垂直（回旋）鏈霉菌。

3 結(jié)論與討論

煙草根際土壤中存在著豐富的拮抗放線菌，由于分離方法的局限及有些放線菌不宜在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)等原因，土壤中還有很多未被發(fā)現(xiàn)的拮抗放線菌。本試驗(yàn)從煙田根際土壤中分離純化得到108個(gè)放線菌單菌落，其中22株對(duì)瓜果腐霉、煙草疫霉、尖孢鐮刀菌的一種有拮抗作用，并篩選出抑菌率均大于50 %的菌株SA74。依據(jù)SA74菌株的形態(tài)特征及在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，以及明膠液化、淀粉水解、纖維素分解、碳氮源利用等生理生化指標(biāo)，將其初步鑒定為鏈霉菌輪生Verticillatus類群。隨后通過(guò)形態(tài)特征觀察和生理生化特性測(cè)定，結(jié)合16S rDNA序列分析，將菌株SA74鑒定為金黃垂直鏈霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）。

王蘭英等[17]發(fā)現(xiàn)金黃垂直鏈霉菌HN6對(duì)香蕉有明顯的防病促生作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金黃垂直鏈霉菌對(duì)煙草土傳病原真菌具有較強(qiáng)抑制效果，其發(fā)酵濾液對(duì)煙草疫霉的抑制率達(dá)73.68%，表明發(fā)酵濾液中含有抗菌活性成分。利用金黃垂直鏈霉菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治的報(bào)道甚少，該菌株的田間防治效果與活性產(chǎn)物分析等有待探究。