楊濤，黎妍妍，鄭露，黃俊斌，黃凱，郭利，周鵬，袁躍斌，彭五星，李錫宏

1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070；

2 湖北省中煙工業(yè)有限責(zé)任公司恩施卷煙廠，湖北 恩施 445000；

3 湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030；

4 湖北省煙草公司十堰市公司，湖北 十堰 442000；

5 湖北省煙草公司襄陽市公司，湖北 襄陽 441100；

6 湖北省煙草公司宜昌市公司，湖北 宜昌 443000；

7 湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445500

煙草赤星病是危害全世界煙草生產(chǎn)最主要的真菌性病害之一，其病原菌屬于半知菌類鏈格孢屬[1]。我國于1916年首次在北京近郊發(fā)現(xiàn)該病，80年代以來，全國煙區(qū)有日益嚴(yán)重的趨勢，尤以黑龍江省、吉林兩省危害最重。1990年以后，該病在我國迅速發(fā)展成為煙草主要病害之一，對煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值有顯著影響[2-5]，煙草赤星病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)對煙葉產(chǎn)量的損失達(dá)到30%，而對產(chǎn)值損失率最高可以達(dá)到90%[6]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2002年煙草赤星病發(fā)生面積2萬公頃，產(chǎn)量損失約2萬公斤，產(chǎn)值損失達(dá)到1.8億元[7]。目前國內(nèi)已報(bào)道的引起煙草赤星病的鏈格孢種類有A.alternata、A. longipes、A. tenuissim、A. yaliinficiens和A. tabacicola，其 中A. alternata和A. longipes可引起云南[8]和貴州煙草赤星病[9]，A. tenuissima可引起重慶煙草赤星病[10]，河南省發(fā)現(xiàn)的煙草赤星病病原菌包含了已知的5個(gè)種[11]，而湖北省煙草赤星病菌由A. tenuissima、A. alternata、A. yaliinficiens和A.longipes4個(gè)種引起，其中長柄鏈格孢A. longipes是優(yōu)勢致病菌，不僅在湖北省各個(gè)煙區(qū)都有分布，且不同地方的菌株致病力存在差異[12]。

ISSR是Zietkiewicz在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)[13]。該技術(shù)已廣泛用于生物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因定位、種質(zhì)資源鑒定、分類、進(jìn)化和遺傳多樣性分析等方面的研究[14-15]。王葉[16]采用ISSR技術(shù)對引起棗果病害的鏈格孢屬病原真菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明在地理區(qū)域劃分中濮陽地區(qū)和山東地區(qū)的菌株能夠大致的分在獨(dú)立的組，說明ISSR技術(shù)可以用做對鏈格孢病原菌的遺傳多樣性研究。胡中會(huì)對赤星病ISSR-PCR正交體系進(jìn)行了優(yōu)化[17]，并采用ISSR和RAPD兩種分子標(biāo)記方法對種群的遺傳多樣性與地理來源的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示菌株的遺傳多樣性和地理來源并無明顯的相關(guān)性[18]。祖艷青[11]采用ISSR技術(shù)對河南省煙草赤星病 鑒 定 為A.alternata、A.longipes、A.tenuissima及A.yaliinficiens的4個(gè)種也進(jìn)行了遺傳多樣性和地理來源的相關(guān)性分析，與胡中會(huì)研究得到的結(jié)果相似。

本研究擬通過ISSR分子標(biāo)記的方法，以湖北省十堰、襄陽、恩施、宜昌等4個(gè)產(chǎn)煙區(qū)的優(yōu)勢致病種—長柄鏈格孢菌為研究對象，對其遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)與分化以及種群間遺傳變異進(jìn)行了多方位的分析，以期為煙草赤星病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

采用單孢分離法，并經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子鑒定從煙草赤星病病斑上獲得了34株長柄鏈格孢菌株，菌株編號和信息見表1。

表1 供試菌株來源以及寄主信息Tab.1 Source of test isolate and host information

1.2 基因組DNA提取及檢測

將供試菌株轉(zhuǎn)入鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，7 d后收集菌絲。采用Huang等[19]CTAB法提取菌株基因組DNA，用0.8%(m/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的完整性，用德國IMPLENP300核酸蛋白超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA的純度和濃度，A260/A280在1.90以上，并將DNA用TE稀釋至終濃度為 50 ng·μL-1，放入 -20℃冰箱保存。

1.3 引物的篩選及ISSR-PCR反應(yīng)體系

所用ISSR引物參考Zietkiewicz[13]、王葉[16]的研究。用擎科生物科技有限公司合成的32條引物進(jìn)行初步篩選，選取8條多態(tài)性好、譜帶清晰、穩(wěn)定可靠的引物(表2)用于對菌株的遺傳關(guān)系研究。采用25 μL的體系進(jìn)行擴(kuò)增，10 μmol/L的上下游引物共2 μL，ddH2O 9.5 μL，20 ng/μL 的 DNA 模板 1μL，反應(yīng)用的PCR Mix12.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。

1.4 遺傳多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)ISSR-PCR條帶的有無，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果構(gòu)建0，1矩陣，并保存為Excel文件格式。利用POPGENE（version 3.2）軟件計(jì)算以下參數(shù)。

反映基因多少和狀況的遺傳參數(shù)：多態(tài)性位點(diǎn)百分率P（Proportion of polymorphic loci），等位基因觀測數(shù)Na（Observed number of alleles）和有效等位基因數(shù) Ne（Effective number of alleles）。

反映基因多樣性信息的遺傳參數(shù)：Shannon 信息指數(shù) I（Shannons information index）[20]，表型多樣性指數(shù)[21]，Nei’s基因多樣性指數(shù)H（Gene diversity within the species）[20]。

反映遺傳分化程度的參數(shù)：總的遺傳多樣性Ht（Gene diversity），群體內(nèi)的遺傳多樣性Hs（Gene diversity within population），群體間遺傳多樣性Dst（Gene diversity among population），Dst = Ht﹣Hs， 遺 傳分化系數(shù)Gst（Coefficient of gene differentiation among population within species），Gst = Dst/Ht。居群每代遷移數(shù)Nm（number of migrants per generation）。

反映基因差異的參數(shù)：不同群體間的遺傳相似性I（Genetic identity）和遺傳距離D（Genetic distance）。對遺傳距離進(jìn)行聚類分析并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

采用NTSYSpc-2.10軟件SHAN程序中的UPGMA（Unweighted pair-group mean average，非加權(quán)算術(shù)平均聚類），按照遺傳相似性對群體進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR引物擴(kuò)增多態(tài)性

用篩選得到的8條重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物擴(kuò)增34個(gè)菌株，部分引物的篩選結(jié)果如下圖所示（圖1），引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖（圖2）；由表2統(tǒng)計(jì)可以看出，8條ISSR引物擴(kuò)增34個(gè)菌株共擴(kuò)增出116個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)99個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（P）為85.34%。引物UBC810的擴(kuò)增位點(diǎn)最多，為18個(gè)；引物UBC811的擴(kuò)增位點(diǎn)最少，為12個(gè)。

圖1 ISSR引物UBC810、UBC826對部分供試長柄鏈格孢菌株的電泳圖Fig.1 Electropherograms of ISSR primers UBC810, UBC826 on some tested strains of A. longipes

圖2 ISSR引物UBC811擴(kuò)增菌株的電泳圖Fig.2 Electropherograms of ISSR primers UBC811 on some tested strains of A.longipes

表2 ISSR引物的多態(tài)性Tab.2 Polymorphism of ISSR primers

2.2 長柄鏈格孢菌菌株的遺傳多樣性分析

2.2.1 長柄鏈格孢菌不同地理來源菌株的遺傳多樣性由軟件POPGENE（version 3.2）計(jì)算得出不同種群菌株的平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為55，Nei’s 多樣性指數(shù)為0.1118 ～0.2061，Shnanon 信息指數(shù)為 0.1972～0.3177；其中十堰菌株的Nei’s多樣性指數(shù)為0.2061，Shnanon信息指數(shù)為0.3177，為4個(gè)地理種群中最高；而宜昌菌株的Nei’s多樣性指數(shù)為0.1118，Shnanon 信息指數(shù)為0.1689，相對其它地理種群較低（表3）。上述結(jié)果表明長柄鏈格孢菌不同地理種群之間有豐富的遺傳多樣性。

表3 基于ISSR標(biāo)記的長柄鏈格孢菌遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity of A. longipes based on ISSR marker

2.2.2 長柄鏈格孢菌不同地理種群的遺傳距離分析

湖北省煙草赤星病長病鏈格孢菌總基因遺傳多樣性為0.1815，種群內(nèi)遺傳多樣性為 0.1605，種群間遺傳分化系數(shù)為0.1305，居群每代遷移數(shù)（Nm）為3.2740（表4）。通過對4個(gè)不同產(chǎn)煙區(qū)種群的基因分化系數(shù)（Gst）分析，種群內(nèi)遺傳多樣性變異占85.34%，表明菌株的遺傳變異主要存在種群內(nèi)。4個(gè)不同地理種群的居群每代遷移數(shù)（Nm）為3.2740＞1，表明在不同地理來源的種群間存在廣泛的基因流動(dòng)，從而阻礙了由遺傳漂變所導(dǎo)致的遺傳分化。

表4 長柄鏈格孢菌株基因多樣性的 Nei’s 分析Tab.4 Nei’s analysis of genetic diversity of Alternaria longipes strains

種群間的遺傳距離結(jié)果見表5。4個(gè)地理來源種群的遺傳距離平均值為0.03915，遺傳相似性平均值為0.9616。十堰和恩施的種群遺傳距離最大為0.0503，而襄陽與十堰種群的遺傳距離最小為0.0282。

表5 長柄鏈格孢菌種群間Nei’s遺傳相似性（I，上三角）及遺傳距離（D，下三角）Tab.5 Nei’s genetic similarity (I, upper triangle) and genetic distance (D, lower triangle) between populations of A. longipes

根據(jù)種群間遺傳距離結(jié)果，按照非加權(quán)算術(shù)平均（UPGMA）法繪制4個(gè)不同種群間聚類分析樹（圖3），4個(gè)種群可以分為兩類，十堰和襄陽的聚為一類，恩施和宜昌的聚為一類。

圖3 長柄鏈格孢菌株病菌種群ISSR聚類分析圖Fig.3 ISSR clustering analysis of A. longipes strains

2.2.3 煙草長柄鏈格孢菌（A. longipes）ISSR聚類分析結(jié)果

由NTSYSpc-2.10軟件構(gòu)建UPGAM的聚類分析樹（圖4）可以看出，供試的34株長柄鏈格孢菌株具有較高的遺傳相似性，其相似系數(shù)為0.52～0.99。當(dāng)相似性系數(shù)設(shè)定為0.79時(shí)，可將34個(gè)供試菌株分為4個(gè)類群：第1類群包括襄陽?？档?個(gè)菌株XYBK-910-2；第2個(gè)類群包括了31個(gè)菌株，是優(yōu)勢類群，菌株來自襄陽、十堰、恩施和宜昌4個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)；第3個(gè)類群只有來自恩施利川市的1個(gè)菌株ESLC-1410-1；第4個(gè)類群是來自十堰市鄖西縣的1個(gè)菌株SY-YX-920-1。34株供試長柄鏈格孢菌株并沒有以不同地理來源完全聚為不同的組。

圖4 34個(gè)長柄鏈格孢菌株的ISSR樹狀聚類圖Fig.4 UPGMA dendrogram of 34 A. longipes strains

3 討論

國內(nèi)外利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對鏈格孢菌的遺傳多樣性進(jìn)行了研究[22-24]，其中祖艷青[11]和胡中會(huì)[18]采用該方法研究了赤星病菌遺傳多樣性和地理來源的關(guān)系，但并沒有對種群的遺傳分化和種群的遺傳變異做進(jìn)一步分析，李六英[25]研究了鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌的遺傳多樣性及遺傳分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌的遺傳多樣性與地理來源有明顯的相關(guān)性，但長柄鏈格孢菌的研究結(jié)果相反，其初步分析了2個(gè)種的遺傳分化特點(diǎn)，但未對遺傳分化結(jié)果和種群的遺傳變異做深入研究。本研究從遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)與分化和種群的遺傳變異多方面對湖北省煙草赤星病優(yōu)勢致病種進(jìn)行了分析。

本研究對湖北省4個(gè)煙區(qū)34個(gè)長柄鏈格孢菌的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明菌株遺傳多樣性處于相對較高的水平，但是不同地理種群間遺傳多樣性水平不一樣，差異并不顯著。另外煙草種植環(huán)境和品種的選擇往往能夠誘導(dǎo)赤星病致病菌等位基因的變異，導(dǎo)致遺傳結(jié)構(gòu)的分化，其分化的程度利用遺傳分化指數(shù)、遺傳距離等進(jìn)行度量，數(shù)值越大，表明群體間的遺傳分化水平越高[26-28]，本研究中，4個(gè)地理來源種群的遺傳分化系數(shù)為0.1305，遺傳距離平均值為0.03915，表明種群間產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化。此外，Wright[29]認(rèn)為當(dāng)種群間的居群每代遷移數(shù)（Nm）大于1時(shí)，表明群體間的基因流動(dòng)發(fā)生多，若小于1，則基因流動(dòng)少，遺傳分化明顯；4個(gè)不同地理種群的Nm為3.2740＞1，說明4個(gè)地理種群存在不同程度的基因交流，可能是由于種植地點(diǎn)都在山區(qū)且氣候相似，遺傳分化的程度不明顯。

由NTSYSpc-2.10軟件對34個(gè)供試菌株構(gòu)建UPGAM的聚類分析樹可知，當(dāng)相似性系數(shù)設(shè)定為0.79時(shí)，可將供試菌株分為4個(gè)類群：其中第1、3、4類群的菌株分別來至不同煙區(qū)，進(jìn)一步說明各煙區(qū)種群間存在一定程度的遺傳分化；但第2種群的31個(gè)菌株來至4個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)，菌株并沒按照地理來源聚為不同的組，表明菌株之間的遺傳多態(tài)性與其地理來源無明顯的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本研究采用ISSR分子標(biāo)記方法對湖北4個(gè)煙區(qū)的34株長柄鏈格孢菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明種群間有豐富的遺傳多樣性，但菌株之間的遺傳多樣性與其地理來源無顯著相關(guān)性；4個(gè)煙區(qū)的菌株產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，但分化的程度不高。該研究通過分析湖北省煙草長柄鏈格孢菌的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)分化以及遺傳多樣性與地理來源的關(guān)系，為后期煙草赤星病的防治奠定了理論基礎(chǔ)。