馬雪瑋，陳哲杰，李鑫，傅超美，章津銘

美洲大蠊（Periplaneta Americana L.）俗稱蟑螂，為蜚蠊科（Blattaria）昆蟲，在我國分布十分廣泛，且藥用歷史悠久。蜚蠊入藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中認(rèn)為其“主血瘀，癥堅、寒熱”具“破積聚，喉咽痹”之功效。漢代末成書之《名醫(yī)別錄》中記載，其能“通利血脈”。至唐代，《唐本草》中記載有“食之下氣”之內(nèi)容。明代本草著作《本草綱目》認(rèn)為其“主淤血，癥堅，寒熱”，功能“下氣，利血脈”[1]。目前中醫(yī)臨床一般認(rèn)為其具有健脾消疳，活血通脈，利水消腫生肌等功效。上世紀(jì)70年代以來，對美洲大蠊進(jìn)行的基礎(chǔ)研究表明，美洲大蠊的不同活性部位具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、提高機(jī)體自身免疫力、促進(jìn)傷口愈合、血管新生、擴(kuò)張血管、改善血液微循環(huán)等作用[2]。

近年來，以美洲大蠊制成的單味動物藥制劑康復(fù)新系列產(chǎn)品在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，且于臨床治療各種原因引起的皮膚及黏膜創(chuàng)傷療效顯著。研究表明，美洲大蠊的主要化學(xué)成分由向外釋放的化學(xué)成分和體內(nèi)存在的化學(xué)成分兩大類組成[2]，其中體內(nèi)所含成分以氨基酸類和核苷類含量最為豐富[3]。目前在各地方標(biāo)準(zhǔn)中對康復(fù)新中間體即美洲大蠊提取物的質(zhì)量評價主要集中于對其所含有的氨基酸進(jìn)行檢測，而同樣含量豐富的核苷類成分并未被納入各地方標(biāo)準(zhǔn)[4～5]。將核苷類成分與氨基酸類成分一起作為美洲大蠊提取物的質(zhì)量評價指標(biāo)將更有利于提高相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量。基于此，本研究采用HPLC方法，以胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷9種核苷類物質(zhì)為研究對象，對三批次美洲大蠊提取物中核苷類成分進(jìn)行了定量測定，以期為中藥大品種康復(fù)新的質(zhì)量控制提供新的思路與方法，為有效提高相關(guān)中藥制劑的質(zhì)量提供參考。

1 儀器和材料

1.1 原料與試劑

美洲大蠊提取物凍干粉（好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司提供，批號：hys16120501）；對照品尿嘌呤（批號：wkq15120505）、次黃嘌呤（批號：wkq16091402）、腺嘧啶（批號：wkq16090203）、胸腺嘧啶（批號：wkq16041501）、肌苷（批號：wkq16090505）、鳥苷（批號：wkq16090703）、腺嘧啶（批號：wkq15120901）、胞苷（批號：wkq16092701）、尿苷（批號：wkq16083105）均購于四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于99%。甲醇為色譜純（美國Fisher公司）；試劑均為分析純。

1.2 儀器

LC-2030 3D型液相色譜儀（日本，島津公司）；BT 40A型超聲波清洗器（成都市，雅源科技有限公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海市，泉杰儀器有限公司）；UPK-1-10T型超純水器（四川，優(yōu)普超純科技有限公司）；HX1002T型電子天平（慈溪市，天東衡器廠）；DFY-200C型粉碎機(jī)（上海市，利聞科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

分別取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘧啶、肌苷、鳥苷對照品適量，精密稱定，分別置于9個不同的容量瓶中，加入2.5%甲醇配制成質(zhì)量濃度為胞嘧啶3.11 mg﹒mL-1、尿嘧啶4.32 mg﹒mL-1、胞苷3.54 mg﹒mL-1、次黃嘌呤3.92 mg﹒mL-1、尿苷3.89 mg﹒mL-1、胸腺嘧啶2.72 mg﹒mL-1、腺嘧啶3.63 mg﹒mL-1、肌苷3.02 mg﹒mL-1、鳥苷3.04 mg﹒mL-1的單一對照品儲備液。分別精密吸取適量各儲備液置于同一個容量瓶中，用2.5%甲醇定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為胞嘧啶0.311mg﹒mL-1、尿嘧啶0.432 mg﹒mL-1、胞苷0.354 mg﹒mL-1、次黃嘌呤0.392 mg﹒mL-1、尿苷0.389 mg﹒mL-1、胸腺嘧啶0.272 mg﹒mL-1、腺嘧啶0.363 mg﹒mL-1、肌苷0.302mg﹒mL-1、鳥苷0.304 mg﹒mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取美洲大蠊提取物凍干粉1 g，加入流動相溶液（2.5%甲醇）定容至50 mL容量瓶，取適量溶液以0.45 μm微孔濾膜濾過，置于進(jìn)樣瓶中，待測。

2.3 測定波長的選擇

取混合對照品溶液適量、美洲大蠊提取物樣品溶液以水為參比溶液，按照紫外可見分光光度法（中國藥典2015 版三部通則0401），在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果在254 nm處有最大吸收，故選擇254 nm為檢測波長。

2.4 HPLC色譜條件

Agilent反相C18烷基硅膠柱（美國安捷倫公司，250 mm×460 mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；柱溫：32 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：水:甲醇=97.5:2.5；體積流量：1.0 mL﹒min-1。

在此色譜條件下得到了混合對照品與美洲大蠊提取物供試品溶液色譜圖分別見圖1與圖2。

圖1 9種核苷類成分混合對照品HPLC色譜圖

圖2 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取混合對照品溶液0.5,1.5,2.5,5,7.5,10 mL分別置于6個10 mL容量瓶中，之后加入2.5%甲醇定容，搖勻。分別將不同濃度的對照品溶液按“2.2”項下要求的條件，按照質(zhì)量濃度由低到高分別進(jìn)樣，對峰面積進(jìn)行測定（混合對照品色譜圖見圖1）。橫坐標(biāo)為進(jìn)樣質(zhì)量濃度（mg﹒mL-1），縱坐標(biāo)為峰面積，進(jìn)行線性回歸，得各指標(biāo)成分的線性回歸方程，結(jié)果見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，各核苷類成分的R2在1～0.9996范圍內(nèi)，R2＞0.999，故認(rèn)為各成分在其所在的濃度范圍線性關(guān)系良好。

表1 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分的線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL，按“2.2”項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，以峰面積計算RSD。結(jié)果見表2。由表中數(shù)據(jù)可知，各組分色譜峰的保留時間波動在0.3min內(nèi)，各核苷類成分峰面積的RSD在1.40%～3.26%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

表2 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分的精密度試驗結(jié)果

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密量取供試品溶液（批號20170912A）1 mL，制備6份供試品溶液，取同一批樣品，按“2.4”項下方法平行制備6份，分別進(jìn)樣10 μL，每份供試品重復(fù)進(jìn)樣3次，按“2.2”項下要求測定含量，計算含量平均值及RSD。結(jié)果見表3。由表中數(shù)據(jù)可以，供試品中各核苷類成分含量的RSD在1.57%～3.22%范圍內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分的重復(fù)性試驗結(jié)果

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.2”項下的色譜條件分別于0,2,4,8,12,24,48 h進(jìn)行，記錄峰面積，以峰面積計算RSD。結(jié)果見表4。由表中數(shù)據(jù)可知6種核苷類成分峰面積的RSD在1.17%～2.63%范圍內(nèi)，供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5.5 加樣回收率試驗 精密量取供試品溶液1 mL，共9份，再精密加入混合對照品溶液1,2,3,5 mL，按照“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，每份重復(fù)進(jìn)樣3次，測定含量，計算含量平均值及RSD。結(jié)果見表5。1.742 mg﹒g-1，平均總含量為 19.376 mg﹒g-1，擬規(guī)定美洲大蠊提取物凍干粉的胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷平均含量分別不低于4.96 mg﹒g-1、0.59 mg﹒g-1、1.05mg﹒g-1、1.97 mg﹒g-1、1.13 mg﹒g-1、0.36 mg﹒g-1、2.28 mg﹒g-1、1.78 mg﹒g-1、1.39 mg﹒g-1，且9種核苷類成分平均總含量不低于15.5 mg﹒g-1（按平均含量的80%計算）。

表5 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分的加樣回收率試驗結(jié)果

尿嘧啶 0.698胞苷 0.979次黃嘌呤 2.389尿苷 1.389胸腺嘧啶 0.438 0.432 1.13 100.00 1.296 1.95 93.70 2.16 2.87 101.72 4.3 5 100.29 0.354 1.42 108.89 1.062 2.08 103.98 1.77 2.77 102.15 3.54 4.52 100.10 0.392 2.9 104.98 1.176 3.56 99.79 1.96 4.35 100.04 3.92 6.29 99.20 0.389 1.79 100.86 1.167 2.58 101.73 1.945 3.45 108.35 3.89 5.31 102.23 0.272 0.72 102.28 0.816 1.27 103.65 1.36 1.84 109.59 2.72 3.16 100.46 0.363 3.19 101.14 98.93 3.61 103.78 3.62 101.00 2.65 103.29 3.31 104.00 3.80腺嘌呤 2.7951.089 3.96 102.72 1.815 4.45 94.28 3.63 6.44 100.54 99.67 3.72 0.302 2.64 102.05肌苷 2.2910.906 3.25 102.31 1.51 3.89 103.88 3.02 5.27 98.21 101.62 2.37 0.304 2.21 108.05 0.912 2.68 100.23 1.52 3.33 102.61 3.04 4.91 106.01鳥苷 1.764 104.22 3.34

表6 美洲大蠊提取物中9種核苷類成分的含量測定結(jié)果

實驗結(jié)果表明，每種核苷成分的平均回收率均在95%～105%范圍內(nèi)，且各回收率的RSD在2.37～3.8%范圍內(nèi)，表明該方法回收率良好。

2.6 樣品含量的測定

取3批美洲大蠊提取物凍干粉，按“2.4”項下要求制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定9種核苷類成分的含量（美洲大蠊提取物溶液色譜圖見圖2），計算平均含量及平均總含量（結(jié)果見表6）。由表中數(shù)據(jù)可知3批美洲大蠊提取物凍干粉中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷的平均含量分別為6.195 mg﹒g-1、0.732 mg﹒g-1、1.310 mg﹒g-1、2.465 mg﹒g-1、1.418 mg﹒g-1、0.445 mg﹒g-1、2.846 mg﹒g-1、2.223 mg﹒g-1、

3 討論與總結(jié)

康復(fù)新系列產(chǎn)品為美洲大蠊成蟲干燥個體提取物制成的單方制劑，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》。中醫(yī)臨床認(rèn)為其具有通利血脈、養(yǎng)陰生肌的功效。目前多將其應(yīng)用于口腔潰瘍、胃出血、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等癥[6]。目前，由于美洲大蠊的飼養(yǎng)基地較多，極易導(dǎo)致不同廠家所使用的康復(fù)新制劑原料存在較大的差異。多個地方標(biāo)準(zhǔn)，對康復(fù)新系列產(chǎn)品的原料及中間體多通過測定總氨基酸含量來控制其質(zhì)量[7]，然而單一成分的檢測往往難以達(dá)到科學(xué)、全面控制其質(zhì)量的目的。因此，亟需引入更多的化學(xué)成分作為美洲大蠊提取物康復(fù)新中間體的質(zhì)量控制指標(biāo)。目前從美洲大蠊體內(nèi)分離出來的化學(xué)成分主要有氨基酸和肽、核苷、多糖、多元醇、甾體和萜類成分，近年又有學(xué)者從中分得生物堿、黃酮和異香豆素等活性物質(zhì)，但目前用于臨床的美洲大蠊制劑的有效成分尚不明確，有待進(jìn)一步的研究與發(fā)現(xiàn)。

核苷類物質(zhì)被公認(rèn)為美洲大蠊提取物的主要化學(xué)成分之一[3]。通過研究，我們對3批美洲大蠊提取物中的9種常見核苷類成分進(jìn)行含量測定，分別為胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘧啶、肌苷、尿苷。且后期相關(guān)實驗結(jié)果顯示不同產(chǎn)地美洲大蠊提取物9種核苷類成分含量差異較大。

本研究建立了HPLC分析方法對美洲大蠊提取物中9種核苷類成分含量進(jìn)行測定，且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，該方法為美洲大蠊相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了技術(shù)手段。