王雷，杜媛鯤，劉慶熠，米源，廖海江，王林

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 胸二科，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué) 期刊社，河北 石家莊 050017）

食管癌的發(fā)病率在全球所有惡性腫瘤中居第8位，其中我國是食管癌高發(fā)區(qū)。食管癌的病理類型主要包括鱗癌和腺癌，盡管近30年來鱗癌發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但食管腺癌發(fā)病率上升了3～4倍，并且多數(shù)患者確診時(shí)即為進(jìn)展期，即使采用根治性手術(shù)聯(lián)合放化療等綜合措施，5年生存率任然＜20%[1-2]。異常激活的Hedgehog（以下簡(jiǎn)稱Hh）信號(hào)傳導(dǎo)通路在惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌的增殖、侵襲及遷移中發(fā)揮重要作用[3-5]。既往針對(duì)食管腺癌Hh通路的研究多集中在上游靶點(diǎn)Smo，針對(duì)Hh通路下游核心靶點(diǎn)Gli1、Gli2的表達(dá)調(diào)控與食管腺癌生物學(xué)行為關(guān)系的研究極少，所以本研究通過siRNA抑制Gli1和Gli2在食管腺癌OE33細(xì)胞中的表達(dá)，探討Gli表達(dá)下調(diào)對(duì)食管腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響，以及可能的分子機(jī)制，旨在為臨床上食管腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系來源 人食管腺癌細(xì)胞系OE33購自英國Sigma-Aldrich公司，

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（美國Gemini公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Corning公司），Silencer?Select Gli1、Gli2和Control siRNA購自美國Life Technologies公 司，Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn) 染試劑（美國Invitrogen公司），總RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液（美國 Applied Biosystems公 司 ），iScript? cDNA 合 成試劑盒（美國 Bio Rad公司），TaqMan? Gli1引物和探針（Hs00171790）、TaqMan? Gli2引物和探針（Hs01119974_m1）、TaqMan?甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Hs02758991_g1）購自美國Life Technologies公司，Pierce-BCA蛋白分析試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Gli2鼠抗人單克隆抗體、p27鼠抗人單克隆抗體、GAPDH鼠抗人單克隆抗體及N-cadherin兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，Gli1兔抗人多克隆抗體和E-cadherin鼠抗人單克隆抗體購自美國abcam公司，Cyclin D1兔抗人單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Matrigel膠和Transwell膜嵌套購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 食管腺癌OE33細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OE33細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板上，第2天待細(xì)胞融合生長(zhǎng)達(dá)50%～60%時(shí)更換無血清培養(yǎng)基，并按照Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行Gli1和Gli2 siRNA干擾引物的轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（Control siRNA）。每組各設(shè)3個(gè)孔，轉(zhuǎn)染時(shí)每孔Gli1和Gli2 siRNA，以及對(duì)照組的濃度均為100 nmol/L，于轉(zhuǎn)染6 h后更換新的培養(yǎng)基，48 h后PBS洗滌細(xì)胞3次，提取各組樣本的mRNA和蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR） ① 總RNA的提?。喊凑湛俁NA提取試劑盒說明書提取各組樣本RNA,并測(cè)定每組樣本RNA濃度。②cDNA合成：按照iScript? cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，每份樣本的反應(yīng)體系為40μl，包含iScript逆轉(zhuǎn)錄酶 2μl，iScript反應(yīng)混合液 8μl和總RNA 500 ng，放置于Veriti? 96-Well Thermal Cycler儀器中進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃變性5 min，42℃退火30 min，85℃延伸5 min。③PCR擴(kuò)增：將每份樣本的cDNA用無R-Nase水稀釋10倍，在384孔板按照10μl/孔的反應(yīng)體系將每組樣本Cdna 4.5μl、Taqman基因表達(dá)預(yù)混液5μl，以及TaqMan?Gli1、Gli2、GAPDH各自的引物和探針0.5μl依次加在孔里，2 000 r/min離心2 min，置于ABI 7900HT高通量qRT-PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 s，60℃變性10 s，72℃退火10 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的Ct值作為內(nèi)參，采用2-ΔCt法進(jìn)行樣本分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè) 用PBS洗滌3次轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，每個(gè)6孔板內(nèi)加含有蛋白酶抑制劑的M-PER細(xì)胞總蛋白提取試劑100μl，收集每組樣本的總蛋白提取液，聚氰基丙烯酸正丁酯法測(cè)定樣本的總蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，工作條件200 V、50 min。冰浴下100 V、1 h轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。室溫5%脫脂奶粉的TBST液封膜1 h，剪膜分別加入一抗Gli-1（1:1 000）、一抗 Gli2（1:250）、一抗 Cyclin D1（1:1 000）、一抗 N-cadherin（1:500）、一抗 p27（1:250）、一抗E-cadherin（1:10 000）及一抗 GAPDH（1:10 000），4℃搖床孵育過夜。第2天TBST洗膜3次，10 min/次，分別加入羊抗鼠或羊抗兔二抗（1:20 000）室溫孵育1h，ECL試劑發(fā)光5 min后暗室曝光顯影，Image軟件檢測(cè)蛋白條帶的表達(dá)。設(shè)定GAPDH為內(nèi)參，每組樣本的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/內(nèi)參蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。將轉(zhuǎn)染48 h后的OE33細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，PBS漂洗后置于4℃、70%冰乙醇固定30 min。用冷PBS漂洗3次，重懸細(xì)胞于含40μg碘化丙啶和100μg RNaseA的PBS中37℃孵育30 min。上機(jī)檢測(cè)各組樣品的DNA含量，采用Muticycle AV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期進(jìn)行擬合分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將鋪好Matrigel基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜平鋪于Transwell小室的下室。收集轉(zhuǎn)染后的OE33細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)液中，吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，加入Transwell小室上室（100μl/室），包含7.5×104個(gè)細(xì)胞。下室加入含10%血清的培養(yǎng)液（500μl/室），37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)24 h，用棉棒擦去上層基質(zhì)膠和未遷移的細(xì)胞，將聚碳酸酯膜用甲醇固定，結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下高倍視野（400倍）觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。每張膜隨機(jī)取4個(gè)視野并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gli1和Gli2基因的表達(dá)

Gli1和Gli2 siRNA組Gli1 mRNA表達(dá)水平為（0.18±0.32），與對(duì)照組（1.00±0.06）比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.300，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組較對(duì)照組降低。Gli1和Gli2 siRNA組Gli2 mRNA表達(dá)水平為（0.30±0.03），與對(duì)照組（1.00±0.05）比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.590，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組較對(duì)照組降低。見圖1。

2.2 Gli1、Gli2、Cyclin D1、p27、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)

Gli1和 Gli2 siRNA組 Gli1、Gli2、Cyclin D1及N-cadherin蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.579、35.340、14.950和14.230，均P=0.000），Gli1和Gli2siRNA組較對(duì)照組減少。Gli1和Gli2 siRNA組E-cadherin、p27蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-75.714和-19.864，均P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組較對(duì)照組增加。見圖2。

2.3 Gli1和Gli2 siRNA對(duì)細(xì)胞周期的影響

圖1 兩組Gli1和Gli2 mRNA的表達(dá)比較

圖2 兩組Gli1、Gli2、Cyclin D1、p27、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達(dá)

Gli1和Gli2 siRNA組G0/G1期細(xì)胞為（64.47±3.14）%，對(duì)照組為（39.07±2.20）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.480，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組增高。Gli1和Gli2 siRNA組S期細(xì)胞為（25.03±1.50）%，對(duì)照組為（58.40±3.34）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.768，P=0.000），Gli1和Gli2 siRNA組降低。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.4 Gli1和Gli2 siRNA對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

Gli1和Gli2 siRNA組相對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)為（0.49±0.06），對(duì)照組為（1.00±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.622，P=0.001），Gli1和Gli2 siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)減少。見圖4。

圖4 Gli1和Gli2 siRNA對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

Hh信號(hào)通路主要由Hh配體、跨膜蛋白受體Ptch、Smo、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控子Gli及下游靶基因等構(gòu)成，其通路的異?；罨谀[瘤形成、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，針對(duì)其通路的靶向抑制也成為抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。目前針對(duì)Hh通路的調(diào)控多集中在Smo，由于存在不依賴Smo激活的非經(jīng)典Hh通路、Hh通路，以及TGFβ、EGFR等通路存在交叉調(diào)控，因此針對(duì)Hh信號(hào)通路的下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli調(diào)控起到更好的抗腫瘤效果。Gli包括Gli1、Gli2及Gli3 3種形式，其中Gli3是轉(zhuǎn)錄抑制因子，而Gli1和Gli2具有轉(zhuǎn)錄激活作用[6]?；罨腉li1和Gli2進(jìn)入細(xì)胞核與下游基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡等，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年來，基因治療作為一種全新的治療模式顯示出良好的應(yīng)用前景，其中RNA干擾被公認(rèn)為是細(xì)胞調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制。本研究應(yīng)用siRNA下調(diào)人食管腺癌細(xì)胞OE33的Gli1和Gli2表達(dá)，觀察其抗腫瘤效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Gli1和Gli2 siRNA 48 h后，OE33細(xì)胞中內(nèi)源性Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，低于對(duì)照組，提示特異性的Gli1和Gli2 siRNA能下調(diào)食管腺癌細(xì)胞中內(nèi)源性Gli1、Gli2的表達(dá)。

細(xì)胞周期紊亂與腫瘤的發(fā)生密不可分，當(dāng)細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)且對(duì)正常負(fù)性調(diào)節(jié)的刺激變?nèi)?，可?dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染Gli1和Gli2 siRNA后，OE33細(xì)胞的周期分布變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Gli1和Gli2 siRNA組可將更多細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而控制腫瘤細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步探討食管腺癌細(xì)胞Gli表達(dá)和周期變化的可能機(jī)制，筆者對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Cyclin D1是細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子也是原癌基因，其可以和CDK4、CDK6形成cyclin D/CDK復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7-8]。此外Cyclin D1也被證實(shí)可作為Hh通路的靶基因，被活化的Hh通路所調(diào)節(jié)[9]。p27能夠通過抑制CDK復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞由G期進(jìn)入S期，當(dāng)p27表達(dá)下降或缺失時(shí)，可誘發(fā)細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10]。關(guān)于食管腺癌Hh/Gli信號(hào)通路與Cyclin D1、p27的關(guān)系未有明確報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，Gli1和Gli2表達(dá)沉默后Cyclin D1蛋白的表達(dá)下降，p27上調(diào)，表明Hh/Gli信號(hào)通路激活后，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的途徑之一可能是通過調(diào)節(jié)Cyclin D1和p27表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，以上皮表型標(biāo)志E-Cadherin下調(diào)，N-Cadherin和Vimentin等間質(zhì)表型特征分子表達(dá)上調(diào)為特征，是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲與轉(zhuǎn)移能力的有效方式之一[11-12]。YUE等[13]研究發(fā)現(xiàn)，活化Hh信號(hào)通路可以調(diào)控EMT過程，促進(jìn)肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，而應(yīng)用Gli抑制劑可以通過上調(diào)E-Cadherin表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞侵襲。本研究結(jié)果表明，抑制Gli1和Gli2表達(dá)后，E-Cadherin表達(dá)上調(diào)，N-Cadherin表達(dá)下調(diào)，Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，Gli1、Gli2表達(dá)沉默后，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，究其原因可能是Hh/Gli通路通過誘導(dǎo)食管腺癌細(xì)胞的EMT過程，促進(jìn)侵襲、轉(zhuǎn)移，而敲掉Gli1和Gli2基因可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程，從而降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

本研究結(jié)果提示，Gli有可能在食管腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，下調(diào)Gli表達(dá)可以抑制食管腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及侵襲，針對(duì)Hh/Gli通路的抑制劑有望成為臨床上治療食管癌的有效措施之一。

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