徐嘉威， 梁君桐， 黃殷琦， 熊業(yè)城， 張子敬, 王二耀, 雷初朝， 陳 宏， 黃永震*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，西安 710061；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002)

KLF3又被稱之為堿性KLF因子(Basic Kruppel-like factor, BKLF)，同其他KLF因子一樣擁有鋅指結(jié)構(gòu)基團(tuán)、核定位信號以及富含氨基酸的功能區(qū)。KLF家族因子含有鋅指結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合DNA中的GC-box或相關(guān)的CACCC元件的一類基本轉(zhuǎn)錄蛋白，其依靠對于有特定GC-box啟動子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過與輔助抑制因子羧基端結(jié)合蛋白(C-terminal binding protein，CtBP)相關(guān)聯(lián)來抑制基因表達(dá)[1]。KLFs在細(xì)胞周期、腫瘤侵襲等重要生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮作用。KLF3基因在各個組織廣泛表達(dá)，而在牛的組織中位于肝臟、肺臟的表達(dá)量較高。通過蛋白功能預(yù)測分析，結(jié)果顯示KLF3在復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)功能以及輔因子的生物合成過程中發(fā)揮作用和作為轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)揮作用的可能性較大[2]。對KLF3的生物學(xué)特性如對脂肪生成、肌肉基因調(diào)控等的深入研究，可為該基因遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，從而對研究影響動物生長發(fā)育及調(diào)控提供了媒介，為今后動物育種提供新思路。

1 KLF3基因蛋白的分子結(jié)構(gòu)

KLF3基因在人體內(nèi)位于4號染色體4p14，擁有8個外顯子，基因全長為37 459 bp。牛的KLF3基因位于6號染色體上，有7個外顯子，其基因全長為27 143 bp，編碼346個氨基酸。豬的KLF3基因定位于8p21.2，擁有8個外顯子，編碼347個氨基酸，與人的KLF3蛋白有高度的同源性[3]。KLF3轉(zhuǎn)錄因子同其他KLF家族中的因子一樣在C端通過Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域與目的序列結(jié)合，并且都有3個并列排列的鋅指結(jié)構(gòu)域。其中，每個結(jié)構(gòu)域中的Zn2+與2個Cys和His在空間上相互作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，3個鋅指結(jié)構(gòu)的序列幾乎完全一致。每個鋅指結(jié)構(gòu)的α螺旋與DNA雙螺旋的大溝結(jié)合，其中α螺旋中特異的堿基與DNA大溝中充滿鳥氨酸的三堿基位點結(jié)合[4]，這3個串聯(lián)重復(fù)排列的鋅指結(jié)構(gòu)域就可與DNA識別位點上的相鄰9個堿基進(jìn)行結(jié)合，并具有一定的周期規(guī)律。

而KLF3蛋白因子上鋅指結(jié)構(gòu)域之間由一段特征性的高度保守的連接序列Thr-Gly-Glu/Ile-Lys-Pro鏈接,此段蛋白鏈接骨架在鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合DNA序列前后的物理特性發(fā)生變化，結(jié)合后變得堅硬化，從而使得KLF3與目的序列結(jié)合的親和性、特異性及穩(wěn)定性增強[5](如圖1所示)。

KLF3的N端為一轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，在該轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域中含有1個Pro-Val-Asp-Leu-Thr的模式作用區(qū)，對于介導(dǎo)KLF3因子與其他蛋白因子相互作用，此轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域與CtBP蛋白結(jié)合區(qū)域序列Pro-X-Asp-Leu-Ser基本一致[6]；KLF3將轉(zhuǎn)錄抑制子C-末端結(jié)合蛋白(CtBP)募集到靶基因的啟動子，因此被認(rèn)為主要作為轉(zhuǎn)錄的阻遏物[7]。除了與CtBP的相互作用外，完全抑制活性還取決于蘇素化[8]。

KLF3可以通過蘇素化進(jìn)行修飾，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)定位和功能的過程。蘇素化涉及將小泛素樣修飾物(SUMO)多肽加入位于共有基序C-賴氨酸-X-谷氨酸中的特定賴氨酸殘基，其中C是疏水殘基，而X可以是任何氨基酸[8]。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)哺乳動物KLF3序列顯示存在符合該共有基序的2個基序,這些基序是VKQE，分別定位于K10和IKIE處的賴氨酸殘基與小鼠K197位置的賴氨酸殘基和人的K198。與定點誘變相結(jié)合的體外和體內(nèi)蘇素化測定證實，可以通過添加SUMO來修飾這些位點,發(fā)現(xiàn)共有基序的賴氨酸或谷氨酸殘基的突變足以防止蘇素化的發(fā)生。

圖1 KLF3鋅指與DNA結(jié)合圖[9]

2 KLF3基因?qū)∪饣蛘{(diào)控的效應(yīng)

KLF家族的因子在肌肉細(xì)胞的發(fā)育過程中扮演重要角色[10]。Cullingford等研究表明，心肌細(xì)胞在接受應(yīng)激刺激時,向細(xì)胞肥大或者凋亡方向進(jìn)展時，KLF3的表達(dá)變化突出，推測KLF3基因的表達(dá)對平滑肌細(xì)胞的發(fā)育分化起到一定影響[11]。Himeda研究發(fā)現(xiàn)，KLF3在骨骼肌細(xì)胞分化的生物學(xué)進(jìn)程中也起到了調(diào)控轉(zhuǎn)錄的作用[12]，通過蛋白質(zhì)組篩選得知,在肌肉肌酸激酶(MCK)的啟動子附近存在大量KLF3，進(jìn)一步的各項實驗均發(fā)現(xiàn)位于MCK啟動子周圍的KLF3結(jié)合該啟動子，在一定條件下也可被其轉(zhuǎn)錄激活。要激活MCK活性單獨依靠KLF3是不行的，還需要依賴于在MCK因子啟動上募集的血清應(yīng)答因子(SRF)。兩者的特定作用區(qū)域同時與MCK的啟動子結(jié)合，啟動了MCK的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)檢測KLF3轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)在肌肉分化期間增加，并且KLF3在內(nèi)源性肌肉基因的啟動子處富集。總之，這些研究表明KLF3在肌肉基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步調(diào)控動物肌肉發(fā)育提供基礎(chǔ)，改良動物肉質(zhì)方面生長性狀。

3 KLF3基因?qū)χ痉只淖饔醚芯?/h2>

2008年，在研究KLF3基因敲除的實驗中表明了KLF3對脂肪生成分化過程中起作用[13]。在這個研究中，研究人員利用遺傳工程小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，通過對KLF3因子C端結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)的靶向性敲除手段來剔除了KLF3基因，結(jié)果顯示敲除后小鼠的出生率雖然下降，但出生的小鼠經(jīng)器官和體重檢測，相比同窩出生的正常小鼠，KLF3基因敲除小鼠在體型方面偏小。經(jīng)過進(jìn)一步的檢測發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)脂肪墊中白色脂肪組織的體積和細(xì)胞減少。此外，通過稱量其他幾個器官，然后相對于小鼠體積做校正之后,發(fā)現(xiàn)似乎只有脂肪組織受到影響。這對于現(xiàn)在普遍的肥胖癥等治療提供了參考。

從細(xì)胞層面分析，小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)用促脂肪生成混合物處理之后，被敲除KLF3基因的MEFs與正常的細(xì)胞比較在分化時更偏向于向脂肪細(xì)胞分化。這表明KLF3因子有抑制脂肪細(xì)胞生成的作用。

在對脂肪細(xì)胞細(xì)胞系3T3-L1中誘導(dǎo)分化的研究時,KLF3因子的mRNA、蛋白表達(dá)水平化等的上調(diào)會抑制該細(xì)胞系向脂肪細(xì)胞分化[14]。通過進(jìn)一步的機制研究顯示，KLF3通過抑制C/EBPα基因的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞分化。在秀麗隱桿線蟲中的研究表明，KLF3通過調(diào)控脂肪酸去飽和途徑基因的表達(dá)水平，參與調(diào)控維持正常脂肪酸復(fù)合物的形成[15]。此外，KLF3是調(diào)控脂蛋白組裝、分泌和脂肪酸β-氧化的重要基因，KLF3中的突變分別降低秀麗隱桿線蟲dsc-4及vit基因的表達(dá)，而dsc-4和vit-5中的突變導(dǎo)致蠕蟲腸中的高脂肪積累。所以KLF3和dsc-4以及vit-5基因之間的遺傳相互作用表明，KLF3可能在調(diào)節(jié)脂質(zhì)組裝和分泌中起重要作用[16]。2015年，王海霞等利用實時定量PCR和過表達(dá)技術(shù)研究了KLF3基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律以及對雞脂肪細(xì)胞的影響效應(yīng)。結(jié)果表明，KLF3和已經(jīng)報道的哺乳動物及線蟲中KLF3相似，在肉雞脂肪組織生長發(fā)育中至少具有2個功能，即抑制脂肪細(xì)胞分化和調(diào)控脂類合成代謝[17]。翟博等為了深入認(rèn)知KLF3基因通過miRNA調(diào)控對脂肪形成與分化所起到的作用，找到了調(diào)控其基因的miRNA，并分析出該途徑在脂肪發(fā)育過程中的調(diào)控機制，為動物脂肪沉積等方面的研究提供了基礎(chǔ)和思路。具體結(jié)果為，miR-21抑制劑可以抑制KLF3基因3′-UTR熒光素酶報告載體的活性，這一抑制作用主要是因為miR-21與KLF3基因3′-UTR的相互作用而產(chǎn)生的；而當(dāng)對結(jié)合位點突變以后，抑制作用消失，這樣的實驗結(jié)果說明了miR-21與KLF3基因3′-UTR之間存在的相互作用，并且可推斷出miR-21與KLF3基因均對脂肪細(xì)胞的分化有相關(guān)性[18]。

4 KLF3基因在家畜育種中的應(yīng)用

2010年，Yin等[19]通過對牛染色體6的QTL精細(xì)定位結(jié)果[20]，選擇KLF3基因作為候選基因，以評估其對中國荷斯坦牛泌乳品質(zhì)的影響。通過PCR產(chǎn)物的直接測序證實KLF3基因的外顯子4中的SNP(NC_007304：g.13849G>C)。通過使用305 d的哺乳期記錄收集每頭牛的產(chǎn)奶量，包括產(chǎn)奶量，脂肪含量，蛋白質(zhì)含量，脂肪百分比和蛋白質(zhì)百分比。在中國的荷斯坦牛群中進(jìn)行了SNP基因型與牛奶生產(chǎn)性狀的進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析，包括1417頭奶牛。發(fā)現(xiàn)該SNP位點與牛奶產(chǎn)量(P=0.022)和蛋白質(zhì)產(chǎn)量(P=0.033)顯著相關(guān)。CC基因型的影響顯著高于其他基因型(P<0.05)。該研究表明，KLF3基因可用于標(biāo)記輔助選擇，作為荷斯坦奶牛育種中產(chǎn)奶量，蛋白質(zhì)含量的分子標(biāo)記基因。西班牙純種馬，也被稱為安達(dá)盧西亞馬，步態(tài)和體型可用作早期選擇標(biāo)準(zhǔn)來檢測具有前瞻性表演能力的幼馬。研究者發(fā)現(xiàn)了1個KLF3基因上的SNP位點(rs68512502)并將其與馬的生長性狀相關(guān)聯(lián)分析，包括了144匹馬。發(fā)現(xiàn)該位點與馬的體長和后管圍顯著相關(guān)(P<0.05)。表明該基因多態(tài)性可用于標(biāo)記輔助選擇(MAS)，以改善期望的體型特征[21]。2017年，朱才業(yè)[22]利用選擇信號檢測方法，將每個顯著的SNP位點向上下游各擴展50 kb作為一個受選擇的區(qū)域,在阿勒泰羊上檢測出與脂肪相關(guān)的KLF3基因，為對阿勒泰羊的分子育種提供了候選基因。Pértille等[23]通過DNA測序及探針法檢測了雞KLF3基因的多態(tài)性與生長性狀相關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在雞4號染色體的KLF3基因的第一和第二內(nèi)含子之間發(fā)現(xiàn)1個SNP位點T>C，并與內(nèi)臟體重和胴體重等生產(chǎn)性狀顯著相關(guān)。

5 小結(jié)與展望

KLF3基因在組織中廣泛表達(dá)，參與到癌癥[24-26]、脂肪細(xì)胞分化、血液中紅細(xì)胞生成[27]、免疫B細(xì)胞的發(fā)育[28-29]、心血管發(fā)育[30]、肌肉基因調(diào)節(jié)等眾多生物學(xué)進(jìn)程。其對機體脂肪分化有抑制作用并影響到脂類物質(zhì)的合成代謝，而對肌肉尤其是骨骼肌細(xì)胞分化起到的重要作用，使其作為一動物育種的重要候選基因，可用于人們對動物生長發(fā)育的相關(guān)經(jīng)濟性狀進(jìn)行有益的篩選改善。但目前存在的問題，一是對KLF3基因調(diào)控肌肉發(fā)育分化方面的研究較少，其作用機制尚不明確，如何通過調(diào)控KLF3基因來對其產(chǎn)生影響鮮有研究；二是缺少KLF3基因與動物生長性狀關(guān)聯(lián)性研究。對KLF3基因調(diào)控等生物學(xué)效應(yīng)的深入研究，能為我國肉用動物育種工作提供極大的幫助。