林小淇+彭越鷥+夏夢(mèng)雨+陳夢(mèng)+高瑩雪+薛瑩雪

[摘要]目的 研究雙缺位Keggin型鎢酸鹽K8[γ-SiW10O36]·12H2O（簡(jiǎn)稱KSiW10）的體外抗腫瘤活性。方法 應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（3-[4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法分析KSiW10對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人肺癌細(xì)胞（A549）以及人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的增殖抑制活性。采用光學(xué)顯微鏡觀察HepG2、A549和MCF-7三種腫瘤細(xì)胞在不同濃度藥物作用后的形態(tài)變化。結(jié)果 鎢酸鹽KSiW10能夠抑制這三種腫瘤細(xì)胞增殖，IC50值分別為9.8×10-5、3.6×10-4和1.8×10-4 mol/L，抑制作用具有藥物濃度依賴性。在經(jīng)藥物KSiW10處理后，HepG2、A549和MCF-7三種腫瘤細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)皺縮、變圓的變化。結(jié)論 鎢酸鹽KSiW10具有體外抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

[關(guān)鍵詞]缺位；鎢酸鹽；抗腫瘤；體外研究

[中圖分類號(hào)] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）1（b）-0007-04

[Abstract]Objective To study the in vitro anti-tumor activity of di-lacunary Keggin-type tungstate K8[γ-SiW10O36]·12H2O （abbreviated form：KSiW10）.Methods The inhibitory effect of KSiW10 on the growth of human hepatoma HepG2 cells，lung cancer A549 cells and breast cancer MCF-7 cells was studied by MTT （3-[4，5-dimethylthiazo-2-y]-2，5-diphenyltetrazolium bromide） assay.The morphological change in HepG2，A549 and MCF-7 cells affected by different concentration of drugs was observed by optical microscopes.Results KSiW10 could inhibit HepG2，A549 and MCF-7 cells proliferation，with IC50 value of 9.8×10-5，3.6×10-4 and 1.8×10-4 mol/L，respectively，showing dose-dependent.The morphological changes in tumor cells showed shrinking of cells and round cells under an optical microscope after treating with different concentrations of KSiW10.Conclusion Tungstate KSiW10 has antitumor activity in vitro and can inhibit the proliferation of tumor cells.

[Key words]Lacunary；Tungstate；Anti-tumor；In vitro study

多酸又稱為聚金屬氧酸鹽（POM），是由高價(jià)態(tài)的過(guò)渡金屬離子如MoⅥ、WⅥ、VⅤ、NdⅤ等與O原子聚合形成的一類金屬-氧簇合物，具有一定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[1]。由于多酸具有體積大、高的熱穩(wěn)定性以及較大的分子式量、多樣的電子結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，因此在抗病毒[2-3]、抗腫瘤[4-7]、抗菌[8-11]等方面的研究取得了顯著的成就。目前，抗腫瘤藥物大多數(shù)都具有較大的毒副作用、低效、選擇性差，并且腫瘤細(xì)胞對(duì)其有一定的耐藥性，因此，研發(fā)效率高、選擇性好、毒副作用小的抗腫瘤藥物是目前科研人員的首要任務(wù)。Keggin型結(jié)構(gòu)的雜多酸鹽化合物具有較強(qiáng)的傳遞、儲(chǔ)存電子能力以及特異的結(jié)構(gòu)特征，在抗腫瘤、抗病毒等方面的應(yīng)用逐漸引起醫(yī)藥領(lǐng)域的重視[12-13]。本文參照文獻(xiàn)[14]合成雙缺位Keggin型鎢酸鹽K8[γ-SiW10O36]·12H2O，選擇人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人肺癌細(xì)胞（A549）以及人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）對(duì)其增殖抑制活性進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

美國(guó)NICOLET公司紅外光譜儀（IMPACT 400 FTIR型，KBr壓片）；上海萬(wàn)衡公司顯微鏡（XDS1C型）；湖南湘儀公司低速離心機(jī)（TDZ5-WS型）；美國(guó)BIORAD公司酶標(biāo)儀（680型）；蘇州蘇凈集團(tuán)超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1B型）；其林貝爾公司微量振蕩器（MH-2型）。

青霉素鈉、硫酸鏈霉素（雙抗，購(gòu)自西安制藥公司），二甲基亞砜（DMSO）、胰酶、MTT（均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），1640培養(yǎng)液、胎牛血清（均購(gòu)自GIBCO公司）。1640培養(yǎng)液溶解鎢酸鹽K8[γ-SiW10O36]·12H2O，配制母液濃度為10-2 mol/L，過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞株

HepG2、A549以及MCF-7（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液[含鏈霉素、青霉素（100 U/ml）]中。

1.3 MTT法分析細(xì)胞增殖力

調(diào)節(jié)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞懸液密度為105個(gè)/ml，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μl的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，把腫瘤細(xì)胞分成空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（藥物的終濃度為10-5、10-4、2.5×10-4、5×10-4、10-3、2.5×10-3 mol/L），每孔培養(yǎng)液的總體積為200 μl，每個(gè)濃度及對(duì)照均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h使MTT還原成為甲瓚。培養(yǎng)終止時(shí)，倒掉上清液，每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀中檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光值（OD值）。增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。endprint

1.4腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，待生長(zhǎng)到70%～80%，將其分成不加藥物的對(duì)照組以及藥物實(shí)驗(yàn)組，加入藥物K8[γ-SiW10O36]·12H2O至其終濃度為2.5×10-4、2.5×10-3 mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物作用后的變化，從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖數(shù)目方面進(jìn)行評(píng)估。

2結(jié)果

2.1紅外光譜

硅鎢酸鹽KSiW10的紅外譜圖見(jiàn)圖1，其在989、941、905、867、815、742、653、553、528、478 cm-1處有吸收峰。

2.2不同濃度KSiW10對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

分別用藥物濃度為2.5×10-4、2.5×10-3 mol/L的KSiW10處理HepG2、A549和MCF-7腫瘤細(xì)胞，研究腫瘤細(xì)胞在經(jīng)藥物作用后的形態(tài)變化，如圖2～圖4所示。在不加藥的對(duì)照組中，腫瘤細(xì)胞形狀是規(guī)則的多邊形，并且細(xì)胞生長(zhǎng)緊貼瓶底，連接緊密，較少的圓形細(xì)胞，生長(zhǎng)密集；而經(jīng)過(guò)藥物KSiW10作用后的腫瘤細(xì)胞，隨著藥物濃度的升高，增殖數(shù)目明顯減少，細(xì)胞密度逐漸降低，細(xì)胞形態(tài)由規(guī)則的多邊形逐漸變圓、皺縮以及縮小。

2.3 MTT比色法分析腫瘤細(xì)胞增殖抑制率

活細(xì)胞的線粒體能夠?qū)TT還原成為紫色結(jié)晶體，其在570 nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)烈的吸收。當(dāng)細(xì)胞增殖能力下降甚至死亡時(shí)，紫色結(jié)晶體在該波長(zhǎng)處的OD值會(huì)降低。研究不同濃度的鎢酸鹽KSiW10對(duì)HepG2、A549以及MCF-7三種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5～圖7所示。

2.3.1 KSiW10對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用 對(duì)于腫瘤細(xì)胞HepG2，藥物作用6 h時(shí)，最高抑制率為23.5%；12 h時(shí)，最高抑制率為65.52%；24 h時(shí)，最高抑制率為83.19%；在藥物作用48 h時(shí)，抑制率增幅不明顯，最高抑制率為83.4%，IC50值為9.8×10-5 mol/L（圖5）。

2.3.2 KSiW10對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用 對(duì)于腫瘤細(xì)胞A549，藥物作用6 h時(shí)，最高抑制率為30.4%；12 h時(shí)，最高抑制率為55.2%；24 h時(shí)，最高抑制率為83.5%；在藥物作用48 h時(shí)，抑制率達(dá)到最大，最高抑制率為93.1%，IC50值為3.6×10-4 mol/L（圖6）。

2.3.3 KSiW10對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用 對(duì)于腫瘤細(xì)胞MCF-7，藥物作用6 h時(shí)，最高抑制率為36.9%；12 h時(shí)，最高抑制率為85.27%；24 h時(shí)，最高抑制率為92.3%；在藥物作用48 h時(shí)，抑制率增幅不明顯，最高抑制率為92.67%，IC50值為1.8×10-4 mol/L（圖7）。

從圖5～7中可以看出，KSiW10能夠抑制HepG2、A549和MCF-7三種腫瘤細(xì)胞增殖，并且隨著藥物濃度的增加，抑制率逐漸增大，具有藥物濃度依賴性。藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，KSiW10對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，提示硅鎢酸鹽KSiW10具有體外抗腫瘤活性。

3 討論

多酸的結(jié)構(gòu)種類多樣，組成元素繁多，形成了種類多樣的化合物，其結(jié)構(gòu)主要有Silverton型、Dawson型、Keggin型、Anderson型等，并且某些化合物表現(xiàn)出較好的體內(nèi)外抗病毒和抗腫瘤活性[15]。

本文利用傅立葉紅外光譜儀對(duì)KSiW10進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，KSiW10的紅外譜圖與相關(guān)文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，提示KSiW10為所要合成的目標(biāo)化合物，并且在1000～700 cm-1范圍內(nèi)，吸收峰989、941、905、867、815 cm-1是W=Od鍵、Si-O鍵、W-Ob-W鍵和W-Oc-W鍵的特征峰[16]，是Keggin型雜多酸鹽的紅外特征譜峰，提示KSiW10具有Keggin型結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞增殖過(guò)?；蛘叩蛲黾?xì)胞減少是惡性腫瘤形成的本質(zhì)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控，因此體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)的主要依據(jù)是能否抑制細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本文利用光學(xué)顯微鏡觀察藥物作用后的腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化，并通過(guò)MTT法檢測(cè)雙缺位Keggin型鎢酸鹽KSiW10對(duì)HepG2、A549以及MCF-7的增殖抑制活性。結(jié)果顯示，KSiW10能夠抑制三種腫瘤細(xì)胞增殖，IC50值分別為9.8×10-5、3.6×10-4和1.8×10-4 mol/L，抑制作用具有藥物濃度及時(shí)間依賴性。光學(xué)顯微鏡下觀察到腫瘤細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)密度降低，增殖數(shù)目減少，圓形細(xì)胞增多，細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮、變圓。

綜上所述，KSiW10具有體外抗腫瘤活性，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖起到抑制作用，并且半數(shù)有效濃度較小，這對(duì)于進(jìn)一步研究多酸抗腫瘤作用機(jī)制及臨床應(yīng)用具有重要的意義。本研究初步發(fā)現(xiàn)KSiW10具有顯著的抑制HepG2、A549以及MCF-7細(xì)胞增殖的活性，但對(duì)于其是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還尚不明確，化學(xué)結(jié)構(gòu)與抑制細(xì)胞增殖和凋亡機(jī)制間的聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-10-10 本文編輯：祁海文）endprint