金雯燕　韋思雨　李佳楠

摘 要 從已測(cè)定凝集素含量的56個(gè)菜豆品種中篩選具有代表性的菜豆品種，分離純化菜豆植物凝集素，MTS法分析其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF7、231）及肝癌細(xì)胞（HEPG2）生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示菜豆植物凝集素能抑制這三種腫瘤細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明菜豆植物凝集素具有一定的體外抗腫瘤活性，可進(jìn)一步篩選高凝集素含量菜豆品種作為分離純化凝集素的原料，為抗腫瘤藥物的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 菜豆植物凝集素 MTS分析 抗腫瘤

中圖分類號(hào)：Q946 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.079

Analysis on Inhibition of Tumor Cell Proliferation

Induced by Kidney Bean Lectin

JIN Wenyan，WEI Siyu， LI Jianan

Department of Biotechnology， School of Life Science， Jianghan University， Wuhan， Hubei 430056）

Abstract The kidney bean lectin was purified by methods of homogenization， centrifugation， ultrafiltration and ammonium sulfate precipitation. Two human breast cancer cell line （MCF7， 231） and one liver cancer cell line （HEPG2） were cultured in vitro and treated with kidney bean lectin. MTS assay was used for detecting the inhibition of tumor cell proliferation.The results showed that there was a significant difference in the inhibition ratio of proliferation after treated by kidney bean lectin. The result also indicated that the inhibition was dose dependent. This study will provide a theoretical basis and technical methods for the genetic improvement of kidney bean quality and utilization.

Key words kidney bean lectin； MTS assay； anti-tumor

凝集素是一種可從植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故稱其為凝集素。有報(bào)道指出，某些凝集素在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)各類腫瘤均有抑制作用；另有報(bào)道，從刀豆種子中提取的一種新型凝集素具有潛在的抗肝癌作用。多種研究表明存在于植物中的凝集素具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性。

在前期研究中，我們已經(jīng)對(duì)56個(gè)品種的菜豆植物凝集素進(jìn)行活性濃度測(cè)定，并成功分離純化到菜豆植物凝集素，本研究擬通過(guò)MTS法檢測(cè)已分離的菜豆植物凝集素對(duì)三種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，判斷其是否具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為菜豆植物凝集素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞（MCF7），人肝癌細(xì)胞（HEPG2），人乳腺癌細(xì)胞株（231）。

1.2 試劑

菜豆植物凝集素（1mg/ml），RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，青、鏈霉素（1%），RPMI-1640完全培養(yǎng)液（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素）。

1.3 方法

1.3.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

三種貼壁細(xì)胞使用RPMI-1640完全培養(yǎng)液，于37.0€癈、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTS法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)

將用以上方法培養(yǎng)獲得的細(xì)胞以2.0x104個(gè)/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml，于37.0€癈、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入濃度分別為1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml的菜豆凝集素0.1ml。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入MTS試劑，放回培養(yǎng)箱3～4h，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)得各孔吸光值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照組A490-實(shí)驗(yàn)組A490）/空白對(duì)照組A490*100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用EXCEL軟件，將吸光值與其相應(yīng)的菜豆凝集素濃度制成統(tǒng)計(jì)圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

形態(tài)觀察結(jié)果顯示，人乳腺癌細(xì)胞（MCF7），人肝癌細(xì)胞（HEPG2），人乳腺癌細(xì)胞株（231）呈現(xiàn)相同生長(zhǎng)趨勢(shì)：（1）正常培養(yǎng)時(shí)，傳代培養(yǎng)后3～4h可貼壁，并呈現(xiàn)長(zhǎng)橢圓形；8-9h后，細(xì)胞緊密貼壁，形狀不一，呈拉扯狀多邊形貼合生長(zhǎng)；24h后，細(xì)胞活躍生長(zhǎng)，大量增殖。（2）加入了不同濃度的菜豆植物凝集素培養(yǎng)24h后，三種細(xì)胞生長(zhǎng)狀況緩慢且貼壁完全不明顯，部分細(xì)胞變圓，甚至出現(xiàn)小細(xì)胞團(tuán)。

MTS結(jié)果顯示（圖1）三種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均受菜豆植物凝集素抑制，且隨著凝集素濃度的依次增加（0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/ml），抑制率依次增加，幅度變大（圖2、圖3、圖4），說(shuō)明菜豆植物凝集素對(duì)這三種腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)具有顯著量效依賴關(guān)系。

3 討論

植物凝集素是一類糖結(jié)合特異性非免疫性蛋白質(zhì)的總稱，其本身具有多個(gè)催化性的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過(guò)專一性識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)上的各種糖結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞內(nèi)部一系列反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞增殖，甚至讓細(xì)胞死亡。各類研究顯示植物凝集素對(duì)不同細(xì)胞系都具有體外凝血活性、抗增殖活性，對(duì)機(jī)體具有抗腫瘤，免疫激活以及抗菌抗病毒等生物活性。本研究結(jié)果亦顯示菜豆凝集素對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用。植物凝集素抑制細(xì)胞增殖的作用方式大致歸于兩大類：自噬與細(xì)胞凋亡途徑。自噬，指的是細(xì)胞本身的溶酶體將細(xì)胞膜內(nèi)的物質(zhì)降解，在細(xì)胞內(nèi)基本細(xì)胞器被降解之后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。植物凝集素結(jié)合至細(xì)胞膜表面糖蛋白或多糖上，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并大量附著于重要細(xì)胞器上，使其通透性改變，激活了自噬，溶酶體降解掉重要細(xì)胞器后，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡途徑中，caspase依賴途徑是較為普遍的一種類型。這種途徑中，最為關(guān)鍵的物質(zhì)是caspase-3，因其底物為多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）和caspase以來(lái)的DNA酶抑制因子（ICAD）。而ICAD作為底物會(huì)被降解成含CAD的其他組分，CAD會(huì)導(dǎo)致DNA發(fā)生典型片段化，使細(xì)胞死亡。植物凝集素在進(jìn)入細(xì)胞之后，會(huì)通過(guò)形成其他物質(zhì)或改變膜電位等方式來(lái)激活caspase系列物質(zhì)，最終激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究中菜豆植物凝集素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

*通訊作者：李佳楠

參考文獻(xiàn)

[1] 劉東亮，呂慧，李婷婷，等.植物凝集素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012.28（6）：669-671.

[2] 薛曉鷗，張少娟，謝偉，等.大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京醫(yī)學(xué)，2008.30（4）：252-253.

[3] 康莊，馮倩，曹厚利，等.菠菜種子胰蛋白酶抑制劑對(duì)K-562細(xì)胞增殖的抑制及促凋亡作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2009.21：684-686.

[4] Huan-Yao Lei， Chih-Peng. Lectin of Concanavalin A as an anti-hepatoma therapeutic agent[J].Journal of Biomedical Science 2009.19（1）：10-16.

[5] Hao Peng， Hui Lv， Ying Wang， Yan-hong Liu， et al. Clematis montana lectin， a novel mannose-binding lectin from traditional Chinese medicine with antiviral and apoptosis-inducing activities[J]. Peptides，2009.30（10）：1805–1815.

[6] LevineB， Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease [J].Cell，2008.132（1）：27-42.

[7] Lei HY， Chang CP. Induction of autophagy by concanavalin A and its application in anti-tumor therapy [J].Autophagy，2007.3（4）：402-404.

[8] Zhang ZT， Peng H， Li CY， et al. Polygonatum cyrtonema lectin induces murine fibrosarcoma L929 cell apoptosis via a caspasedependent pathway as compared to ophiopogon japonicus lectin[J].Phytomedicine，2010.18（1）：25-31.