王媛媛　曹建　萬建華

[摘要]目的 研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子2（VEGF-2）在間歇性低氧對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的表達(dá)及保護(hù)機(jī)制。方法 選取72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=18）、I/R+間歇性低氧（I/R+IH）組（n=18）、I/R組（n=18）、I/R+IH+磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑組（I/R+IH+PI3K抑制劑組）（n=18），將大鼠暴露于低氧循環(huán)制作間隙性低氧動(dòng)物模型，采用球囊結(jié)扎冠脈方法制作心肌缺血/再灌注動(dòng)物模型。通過試劑盒檢測(cè)心肌組織丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，通過超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)大鼠舒張末期容積、收縮末期容積、左心室射血分?jǐn)?shù)，通過Western blot法檢測(cè)蛋白激酶B（AKt）、HIF-1α、VEGF-2表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，I/R組的MDA、CK-MB高于假手術(shù)組，GSH低于假手術(shù)組，左心室舒張末期容積及收縮期末期容積高于假手術(shù)組，左心室射血分?jǐn)?shù)低于假手術(shù)組，AKt蛋白及HIF-1α、VEGF-2表達(dá)低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。I/R+IH組反映氧化損傷的MDA、CK-MB低于I/R組，GSH高于I/R組；左心室舒張末期容積及收縮期末期容積低于I/R組，左心室射血分?jǐn)?shù)高于I/R組，AKt蛋白及HIF-1α、VEGF-2表達(dá)高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。I/R+IH+PI3K抑制劑組的MDA、CK-MB高于I/R+IH組，GSH低于I/R+IH組；左心室舒張末期容積及收縮期末期容積高于I/R+IH組，左心室射血分?jǐn)?shù)低于I/R+IH組，AKt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表達(dá)低于I/R+IH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 IH在心肌缺血損傷中具有心臟保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與激活磷脂酰肌醇酯3-激酶信號(hào)通路及促進(jìn)HIF-1α、VEGF-2表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]間歇性低氧；磷脂酰肌醇3-激酶；心肌缺血/再灌注；低氧誘導(dǎo)因子α；血管表皮生長因子2

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）1（a）-0004-04

[Abstract]Objective To study the expression of phosphatidylinositide 3-kinase signaling pathway （PI3K），hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α），vascular endothelial growth Factor-2 （VEGF-2） and to studied the correlation protection mechanism of intermittent hypoxia on heart ischemia/reperfusion （I/R） injury in rats.Methods 72 rats were randomly divided into the sham-operated group （n=18），the myocardial I/R group （n=18），the myocardial I/R+intermittent hypoxia （IH） group （I/R+IH） （n=18） and the myocardial I/R+IH+phosphatidylinositide 3-kinase （PI3K） inhibitor （wortmannin ） group （IH+I/R+PI3K inhibitor group） （n=18）.Mice were exposed to cycles to establish the IH model.I/R model was established by ligating the left anterior descending coronary artery.The MDA and GSH of cardic muscle tissues，and the serum biomarkers CK-MB in the four groups were detected.The LV end-diastolic volume （LVEDV），LV end-systolic （LVESV），LV ejection fraction （LVEF） of the rats by echocardiography after 8 weeks were assessed.The expression of phosphorylation of protein kinase B （Akt），HIF-1α，VEGF-2 was analyzed by Westen -blot.Results The level of MDA，CK-MB，LVEDV，LVESV of the I/R group was higher than that of the sham-operated group，the value of GSH，LVEF and the expression of AKt，HIF-1α，VEGF-2 of the I/R group was lower than that of the sham-operated group，with significant difference （P<0.05）.The level of MDA，CK-MB，LVEDV，LVESV of the I/R+IH group was lower than that of the I/R group，the value of GSH，LVEF and the expression of AKt，HIF-1α，VEGF-2 of the I/R+IH group was higher than that of the I/R group，with significant difference （P<0.05）.The level of MDA，CK-MB，LVEDV，LVESV of the I/R+IH+PI3K inhibitor group was higher than that of the sham-operated group，the value of GSH，LVEF and the expression of AKt，HIF-1α，VEGF-2 of the I/R+IH+PI3K inhibitor group was lower than that of the sham-operated group，with significant difference （P<0.05）.Conclusion The PI3K/Akt pathway and the expression of HIF-1α，VEGF-2 is important for IH-induced cardioprotection and may represent aviable target to reduce myocardial I/R injury.endprint

[Key words]Intermittent hypoxia；Phosphatidylinositide 3-Kinase；Myocardial ischemia reperfusion；Hypoxia-inducible factor 1α；Vascular endothelial growth factor-2

間歇性低氧是指給機(jī)體以反復(fù)的中等強(qiáng)度的低氧刺激，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)此種乃至更高程度低氧的耐受力，以避免對(duì)機(jī)體真正不可逆損傷的產(chǎn)生[1]。有研究顯示，低氧適應(yīng)可以增加心臟對(duì)缺氧缺血損傷的保護(hù)作用[2]。PI3K及下游靶蛋白所組成的信號(hào)途徑是目前細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在間歇性低氧條件下，PI3K、HIF-1α、VEGF2在心肌缺血/再灌注損傷中的表達(dá)及保護(hù)機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過，許可證號(hào)為SCXK（贛）2009-0001。取10周左右雄性SD大鼠72只，體重（180±18）g，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要儀器與試劑

渥曼青霉素購自Alexis公司，谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）監(jiān)測(cè)試劑盒（武漢亞法生物制品有限公司），小鼠抗Akt單克隆抗體、HIF-1α抗體、VEGF-2抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Sigma公司，蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品購自普利萊公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組，制作大鼠制作間歇性低氧模型[3]，具體如下。每日在低氧氧艙分別接受4次減壓低氧處理，每次低氧循環(huán)接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再氧和處理5次，間歇性低氧處理14 d。未進(jìn)行低氧處理的大鼠作為對(duì)照組。制作大鼠缺血/再灌注模型，10%水合氯醛麻醉大鼠，按文獻(xiàn)方法制作制作模型治療[4]。假手術(shù)組（n=18）：絲線穿過冠狀動(dòng)脈但左室支但不結(jié)扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；I/R組（n=18）：制作大鼠缺血/再灌注模型；IH+I/R組（n=18）：建立間歇性低氧動(dòng)物模型后，制作缺血/再灌注模型；IH+I/R+PI3K抑制劑組（渥曼青霉素）（n=18）：建立間歇性低氧模型，制作缺血/再灌注模型時(shí)，冠狀動(dòng)脈左前降支閉塞15 min前注射磷脂酰肌醇酯3激酶抑制劑-渥曼青霉素（腹腔注射）。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 MDA、GSH、CK-MB含量監(jiān)測(cè) 缺血/再灌注2 h后自腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置30 min，離心10 min（4℃，3000 r/min），血清分離，按試劑盒說明測(cè)定MDA、GSH、CK-MB含量。

1.4.2大鼠左心室收縮期末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)大鼠在外科處理8周后行超聲心動(dòng)圖檢查。采用異氟烷輕度全身麻醉，選取12 MHz探頭，二維心室圖從胸骨旁長軸短軸和四個(gè)腔室定位獲得，通過Modified Simpson Rule測(cè)量左心室收縮末期容積（LVESV）及舒張末期容積（LVEDV），計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)，同一觀察者采用雙盲法測(cè)量所有測(cè)量值，所有測(cè)量結(jié)果連續(xù)測(cè)5次取平均值。

1.4.3 Western blot法檢測(cè) Akt、HIF-1α、VEGF2蛋白表達(dá) 制模結(jié)束后處死手術(shù)處理后的存活大鼠，提取碾磨心肌組織，按蛋白提取試劑盒說明書步驟提取總蛋白，BCA法蛋白進(jìn)行蛋白定量，收集上清液，SDS-PAGE分離樣品后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，常溫下TBST封閉過夜，再加入一抗，沉淀，洗膜，顯色。具體方法參照文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)z片掃描后用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，比值結(jié)果表示蛋白的相對(duì)含量，用Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各實(shí)驗(yàn)組MDA、GSH、CK-MB水平的比較

與假手術(shù)組比較，I/R組反映氧化損傷的MDA、CK-MB含量高于假手術(shù)組，GSH含量低于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組比較，IH+I/R組的CK-MB、MDA含量低于I/R組，GSH含量高于I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與IH+I/R組比較，IH+I/R+PI3K抑制劑組的CK-MB、MDA含量高于IH+I/R組，GSH含量低于IH+I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2各實(shí)驗(yàn)組大鼠左室容積、射血分?jǐn)?shù)的比較

各實(shí)驗(yàn)組外科處理后，8周后通過超聲心動(dòng)圖測(cè)LVEDV、LVESV、LVEF。I/R組的LVEDV、LVESV、LVEF與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IH+I/R組的LVEDV、LVESV、LVEF與I/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示間歇性低氧對(duì)缺血/再灌注損傷的大鼠心功能有保護(hù)作用；IH+I/R+PI3K抑制劑組的LVEDV、LVESV、LVEF與IH+I/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），使用PI3K抑制劑組后，間歇性低氧對(duì)缺血/再灌注損傷大鼠心功能保護(hù)作用下降（表2）。

2.3各實(shí)驗(yàn)組心肌組織Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表達(dá)

通過Western blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白水平，結(jié)果顯示，I/R組的Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IH+I/R組的Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表達(dá)高于I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示間歇性低氧促進(jìn)了Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表達(dá)增加；IH+I/R+PI3K抑制劑組的Akt、HIF-1α、VEGF2蛋白表達(dá)低于IH+I/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示在間歇性低氧狀態(tài)下，PI3K抑制劑組不僅對(duì)Akt表達(dá)有關(guān)，而且HIF-1α、VEGF-2表達(dá)與PI3K信號(hào)通路激活有明顯關(guān)系（表3、圖1）。endprint

3討論

間歇性低氧適應(yīng)可減輕應(yīng)激、缺血/再灌注及心律失常等心肌損傷，長期適應(yīng)高原低氧能增加心臟對(duì)缺血損傷的適應(yīng)能力[5-6]。但是目前關(guān)于間歇性低氧具體心肌保護(hù)作用機(jī)制的研究還是非常匱乏。

磷脂酰肌醇-3激酶是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的脂類第二信使，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、改善心肌收縮力及間接調(diào)節(jié)鈣通道鈣離子內(nèi)流等方面調(diào)節(jié)心肌功能[7-8]，在缺血/再灌注損傷中有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)建立間歇性低氧模型，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧預(yù)處理后，Akt蛋白表達(dá)高于I/R組，MDA、CK-MB含量低于I/R組，GSH含量高于I/R組，左心功能改善；而使用PI3K抑制劑組后，Akt蛋白表達(dá)低于IH+I/R組，MDA、CK-MB含量高于IH+I/R組，GSH含量低于IH+I/R組，LVEF低于IH+I/R組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示間歇性低氧可以激活PI3K-Akt信號(hào)途徑，增加AKt蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞氧化損傷及減輕心肌缺血/再灌注損傷。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α及其下游因子VEGF-2在間歇性低氧處理后的表達(dá)，HIF-1α位于細(xì)胞質(zhì)中，但在低氧條件下，HIF-1α穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性可顯著增加，在缺血組織中介導(dǎo)促血管生成的作用[9-11]。血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移、趨化，形成新血管。血管內(nèi)皮生長因子VEGF-2在組織缺氧時(shí)能刺激血管新生[12-14]，而且還具有抑制凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)血管新生，維持內(nèi)皮細(xì)胞存活的功能[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，間歇性低氧處理后，PI3K-Akt信號(hào)通路激活，心肌缺血/再灌注損傷減輕，HIF-1α表達(dá)增加，下游因子VEGF-2增加，間歇性低氧心肌保護(hù)作用與間歇性低氧狀態(tài)AKt活化減少細(xì)胞氧化損傷減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，同時(shí)也與低氧誘導(dǎo)因子及血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)新生血管有關(guān)，而使用PI3K抑制劑后，AKT表達(dá)下降的同時(shí)，HIF-1α及下游因子VEGF-2表達(dá)也同時(shí)下降，提示低氧誘導(dǎo)因子及血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)中需要激活PI3K-Akt信號(hào)途徑，需要AKt蛋白高表達(dá)，同時(shí)提示PI3K/AKT通路除了減輕氧化損傷調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡外，還在新生血管的形成中發(fā)揮著重要作用。除此之外，PI3K/AKT信號(hào)通路還可能通過抑制促凋亡蛋白、調(diào)節(jié)鈣離子在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中的濃度，促進(jìn)心肌細(xì)胞能量的代謝以及抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)行等過程完成多種機(jī)制發(fā)揮心肌保護(hù)作用[18-20]，其內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步研究探討。

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（收稿日期：2017-09-20 本文編輯：祁海文）endprint