李劍飛 蔡茂德 鐘 亮 曾 湖 韋華軍 楊長福

作為來源于上皮的,1種惡性腫瘤，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是由生活環(huán)境和遺傳相互影響的典型疾病，包括低分化鱗癌和未分化癌[1-2]，另有臨床統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)[3]，在對(duì)世界范圍內(nèi)的鼻咽癌患者進(jìn)行診療時(shí)，都能檢出EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)的病毒核抗原和核酸組織，后經(jīng)多方考證，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為對(duì)于EBV的研究將會(huì)對(duì)鼻咽癌的診療和預(yù)后提供有價(jià)值的新貢獻(xiàn)[4]。本文以在我院接受治療的45例鼻咽癌患者和37例鼻咽炎患者為研究對(duì)象，探討了EBV miRNAs(包括EBV-miR-BART4*和EBV-miR-BART18-3P)在鼻咽癌病灶中的表達(dá)情況，現(xiàn)將研究成果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本文篩選2014年7月至2016年5月間在我院接受治療的45例鼻咽癌患者和37例鼻咽炎患者為研究對(duì)象，其中鼻咽癌患者中有男性26例，女性19例，年齡33～61歲，平均年齡(46.17±5.39)歲；鼻咽炎患者中有男性15例，女性22例，年齡18～59歲，平均年齡(34.62±3.14)歲。上述所有患者入選前均經(jīng)過病理學(xué)診斷，確診其癥狀分別為鼻咽低分化鱗癌和慢性鼻炎粘膜炎，此外所有患者對(duì)于本研究的內(nèi)容和性質(zhì)均知情且同意，并上報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。上述兩種患者一般資料的數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

本研究的試驗(yàn)方法主要是對(duì)從病灶組織中提取得到的miRNA進(jìn)行PCR實(shí)時(shí)定量分析，從而了解EBV病毒的miRNA在患者體內(nèi)的表達(dá)情況。

1.2.1 合成PCR引物 首先借助miRNA數(shù)據(jù)庫來查找EBV-miRNA即EBV-miR-BART4*和EBV-miR-BART18-3P的序列情況，采用丹麥Exiqon公司的U6 snRNA (hsa,mmu,rno) PCR primer set,UniRT等來合成PCR引物。

1.2.2 提取病灶組織中的RNA 采用美國Invitrogen公司制造的RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，再用德國Eppendorf公司生產(chǎn)的生物分光光度計(jì)檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度情況，要求其在280 nm波長下吸光度與260 nm波長下的吸光度比值在1.8～2.1之間，最后將其保存于零下80 ℃的冰箱中。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用丹麥Exiqon公司生產(chǎn)的cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照相應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，再采用該公司的SYB?Green master mix和Universal RT試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)，該檢測(cè)反應(yīng)在由美國ABI公司生產(chǎn)的7500型號(hào)的熒光定量PCR儀器上按照一定的擴(kuò)增條件進(jìn)行反應(yīng)，注意此時(shí)反應(yīng)中引入內(nèi)參物miR-U6。

1.3 治療指標(biāo)

觀察EB病毒微小RNA在鼻咽癌和鼻咽炎組織中的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

鼻咽癌組織中EB病毒兩種miRNAs的表達(dá)水平明顯高于鼻咽炎組織，數(shù)據(jù)間具有非常顯著的差異性(P<0.01)，見表1。

表1 鼻咽癌和鼻咽炎組織中EB病毒miRNAs的表達(dá)數(shù)值(Ct值)分析

3 討論

鼻咽癌在我國南方地區(qū)、東南亞國家和非洲部分地區(qū)為多發(fā)病，尤其是在我國南方地區(qū)其病死率排在所有惡性腫瘤中的第四位[5]。目前臨床上對(duì)于此病主要以放射治療為主，化學(xué)治療為輔[6]，但這對(duì)病灶較微小的腫瘤組織和在循環(huán)系統(tǒng)中可以轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞無法起到良好的殺滅作用，同時(shí)又很容易帶來諸多不良反應(yīng)，在對(duì)患者的正常免疫功能造成損害的情況下又給患者帶來了額外的治療痛苦。據(jù)報(bào)道[7]，NPC與眾多惡性腫瘤一樣在人體內(nèi)具有逃避免疫的機(jī)制，這就無法使免疫系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)。隨著抗腫瘤研究日益進(jìn)步，目前已有1種新的治療理念出現(xiàn)，亦即篩選出有效且在腫瘤細(xì)胞表面能夠進(jìn)行大量持久表達(dá)的抗原靶點(diǎn)，再用其來制備相應(yīng)的腫瘤疫苗，以便達(dá)到機(jī)體自身免疫系統(tǒng)可以對(duì)其進(jìn)行特異性免疫清除的治療目的[8]，本文的研究意義也正是如此。曾有報(bào)道認(rèn)為[9-10]，miRNA和靶基因之間可以進(jìn)行互相調(diào)控來影響表達(dá)，而鼻咽癌在早期就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)移，可見miRNA可能正是在早期通過高表達(dá)來與靶基因進(jìn)行互相調(diào)控才導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的。由數(shù)據(jù)分析可知，EB病毒miRNA確實(shí)可以通過高表達(dá)來影響鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，EB病毒微小RNA可在早期以顯著的表達(dá)水平導(dǎo)致鼻咽癌的發(fā)病和病灶轉(zhuǎn)移，故將其作為防治、診斷鼻咽癌的生物分子標(biāo)志物是有一定可能性的。

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[2] 宗井鳳.基于調(diào)強(qiáng)放療的鼻咽癌臨床分期研究以及EB病毒miRNA-BART7在臨床中的應(yīng)用價(jià)值〔D〕.福建醫(yī)科大學(xué),2014.

[3] 王 艷,王曉枚,成志強(qiáng),等.鼻咽癌患者外周血及腫瘤原發(fā)部位的病毒檢測(cè)及意義〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志,2014,41(5):393-395.

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[5] 韋保和,黎柱楊,李海鳳,等.1981～2010年鼻咽癌高發(fā)地區(qū)鼻咽癌患者發(fā)病年齡變化分析〔J〕.廣西醫(yī)學(xué),2016,38(6):825-828.

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[9] 劉 剛,田道法,張 莉,等.鼻咽癌干細(xì)胞miRNA表達(dá)特征研究〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志,2014,22(5)：38-39.

[10] 李 璐,王建紅,黃 輝,等.EB病毒miR-BART4～*和miR-BART18-3p在鼻咽癌中的表達(dá)及意義〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,50(9):1267-1270.