李 鑫 王 震 鄧 雅 趙 昆 陳俊強(qiáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，南寧市 530021)

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率位居惡性腫瘤的第三位，相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率位居第四位[1]。外泌體(exosome，EXOs)是細(xì)胞內(nèi)的多泡體與質(zhì)膜融合后釋放的、直徑40～100 nm的囊泡，其中富含各種蛋白質(zhì)、核酸及其他重要物質(zhì)。通過(guò)這些物質(zhì)，外泌體成為細(xì)胞與微環(huán)境之間相互作用的橋梁。在人體內(nèi)，多種體液如血液、尿液、腹水及羊水中均能檢測(cè)到外泌體的存在。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中外泌體的含量明顯增多，且其中富含熱休克蛋白、P53蛋白及磷酸酶等腫瘤調(diào)節(jié)因子[2]；腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體不但可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，還能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[3-4]。因此，本研究將探討胃癌耐藥細(xì)胞株分泌的外泌體是否對(duì)胃癌敏感細(xì)胞株傳遞耐藥特性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 胃癌敏感細(xì)胞株(SGC-7901)及其阿霉素耐藥株(SGC-7901/VCR)(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，CO2恒溫培養(yǎng)箱(3110，NUNE公司)，超凈工作臺(tái)(THM#51013522，Thermo公司)，酶標(biāo)儀(Multiskan FC，Thermo公司)，熒光倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(OLYMPUS IX71，奧林巴斯)，完全1640培養(yǎng)基及不完全1640培養(yǎng)液，CCK-8(細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒，CA1210 Solarbio)長(zhǎng)春新堿(KGA8251，凱基生物)，超速離心機(jī)(Optima L100/90/80，Beckman)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SGC-7901、SGC-7901/VCR細(xì)胞接種于完全1640培養(yǎng)基中，在37℃、5 ml/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)與傳代，SGC-7901/VCR在含完全1640培養(yǎng)基加1.0 mg/L長(zhǎng)春新堿至實(shí)驗(yàn)前2周無(wú)藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以上細(xì)胞培養(yǎng)至增殖期分別處理。

1.3 CCK-8法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 分別取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的親代細(xì)胞SGC-7901、耐藥細(xì)胞SGC-7901/VCR和共培養(yǎng)細(xì)胞株SGC-7901/VCR/EXO，分別計(jì)數(shù)，以3×105個(gè)的濃度接種于96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每12 h取6孔，用CCK-8連續(xù)測(cè)定10次，最終以測(cè)定的次數(shù)為橫軸，每次的吸收光度值的平均值為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算倍增時(shí)間。

1.4 細(xì)胞外泌體提取與鑒定 細(xì)胞在完全1640培養(yǎng)基增殖期更換為不含血清的不完全1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基離心，4℃、300 g、10 min，取上清液，4℃、2 000 g、10 min，取上清離心，4℃、10 000 g、30 min，除去培養(yǎng)基中的細(xì)胞碎片，留取上清離心，4℃、100 000 g、70 min，得到含有蛋白質(zhì)的外泌體，用PBS緩沖液重懸外泌體洗滌2遍，得到的沉淀即為細(xì)胞外泌體，用40 μL PBS重懸。取20μL外泌體懸液滴加于載樣銅網(wǎng)上，靜置1 min，吸干液體后靜置5 min，于銅網(wǎng)上滴加30 g/L磷鎢酸溶液約10 μL，負(fù)染5 min，吸干液體，在透射電鏡拍照前用白熾燈65℃烘烤約15 min。

1.5 CCK-8法測(cè)定胃癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的藥物敏感性 SGC-7901細(xì)胞，攝取VCR/EXO的SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/VCR細(xì)胞，于增殖期用2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入1640完全培養(yǎng)基形成單細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)細(xì)胞分別接種于96孔板，在50 mg/L CO2、37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，用不同濃度的長(zhǎng)春新堿處理48 h后，在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(x±s)表示，多組間計(jì)量資料比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LDS法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞倍增時(shí)間比較 SGC-7901、SGC-7901/VCR和SGC-7901/VCR/EXO細(xì)胞倍增時(shí)間分別為(31.54±1.37)h、(47.21±1.65)h和(42.89±1.73)h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=311.650，P<0.001) 。耐藥細(xì)胞株和共培養(yǎng)細(xì)胞株增長(zhǎng)速度明顯大于親代細(xì)胞株。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線

2.2 細(xì)胞外泌體的形狀 投射電子顯微鏡視野下可觀察到外泌體呈典型的橢圓形杯口狀結(jié)構(gòu)，直徑40～100 nm。見(jiàn)圖2。

圖2 投射電子顯微鏡下外泌體形態(tài)

2.3 不同細(xì)胞株顯微鏡下形態(tài)比較 用耐藥細(xì)胞株外泌體共培養(yǎng)的細(xì)胞SGC-7901/VCR/EXO形態(tài)和親代細(xì)胞SGC-7901相比發(fā)生了明顯的改變，其細(xì)胞形態(tài)不如親代細(xì)胞圓滑，向棱角分明的耐藥細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。見(jiàn)圖3。

圖A SGC-7901

圖B SGC-7901/VCR/EXO

圖C SGC-7901/VCR

2.4 藥物敏感性分析 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敏感細(xì)胞株SGC-7901對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50為2.58 μg/mL，耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50為12.65 μg/mL，耐藥細(xì)胞株SGC-7901/VCR的耐藥指數(shù)為4.90。與VCR/EXO共培養(yǎng)后敏感細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的IC50為6.54 μg/mL，耐藥性提高了2.53倍。

3 討 論

胃癌的治療，目前主張是以手術(shù)為主，以放、化療為輔的綜合治療。其中，術(shù)后輔助化療已經(jīng)成為進(jìn)展期胃癌標(biāo)準(zhǔn)治療方案的一部分。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，圍術(shù)期化療不僅能改善胃癌患者的生活質(zhì)量，還能延長(zhǎng)生存期[5]。但胃癌的化療并未達(dá)到預(yù)期的治療效果，其主要原因?yàn)榛熌退?。因此，胃癌化療的耐藥性是困擾臨床醫(yī)師的一個(gè)重要難題。文獻(xiàn)報(bào)道有超過(guò)50%的胃癌患者存在耐藥現(xiàn)象[6]，細(xì)胞外泌體(exosome)作為細(xì)胞間的新型通訊工具，隨著對(duì)其組分和功能的深入了解，其在耐藥中的作用越來(lái)越引起人們的重視。Lv等[7]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了多西他賽耐藥的細(xì)胞株所分泌的外泌體，其作用于多西他賽敏感的細(xì)胞株后，敏感細(xì)胞株對(duì)多西他賽的耐藥性增強(qiáng)；進(jìn)一步對(duì)耐藥細(xì)胞株分泌的外泌體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中P-糖蛋白含量增加。

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境，其具有組織缺氧、低pH(酸中毒)、間質(zhì)高壓形成、產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子、細(xì)胞趨化因子和蛋白水解酶等，從而具有激發(fā)免疫炎性反應(yīng)等特點(diǎn)。組織缺氧可激發(fā)腫瘤一系列的適應(yīng)過(guò)程，誘導(dǎo)惡性表型的發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥[8]。而腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，由于自身和環(huán)境的影響，會(huì)產(chǎn)生不同程度的異質(zhì)性。腫瘤的異質(zhì)性表現(xiàn)在同一瘤體內(nèi)的不同腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性不一致；依據(jù)化療敏感性對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，可以分為耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞。研究表明，這種存在于腫瘤細(xì)胞之間對(duì)化療藥物敏感性的不一致性，可以在細(xì)胞之間相互傳遞，從而使敏感細(xì)胞獲得耐藥性。外泌體內(nèi)存在大量的非編碼RNA和蛋白等物質(zhì)，在這種耐藥性的傳遞中起著重要作用。

miRNA在外泌體誘導(dǎo)耐藥中發(fā)揮著重要作用，Chen等[9-11]研究表明，多西他賽耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7相比于敏感株，miRNAs(miR-196a、miR-21、miR-29a、miR-29a/miR-100和MiR-30a)升高，多西他賽耐藥株細(xì)胞外泌體作用與敏感細(xì)胞能顯著提高敏感株的耐藥性。Challagundla等[12]報(bào)道，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(NBL)釋放的外泌體富含miR-21，將此外泌體和單核細(xì)胞共培養(yǎng)后注入此單核細(xì)胞與荷瘤小鼠，明顯增加了荷瘤小鼠對(duì)順鉑的抵抗。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞內(nèi)CD97 的表達(dá)可以影響胃癌細(xì)胞的增殖與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種調(diào)控作用是通過(guò)腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體實(shí)現(xiàn)的。

蛋白也在外泌體誘導(dǎo)耐藥中參與作用，外泌體可以將轉(zhuǎn)運(yùn)多耐(multi-drugresistance，MDR)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到敏感的受體細(xì)胞內(nèi)來(lái)誘導(dǎo)或者增強(qiáng)敏感細(xì)胞的耐藥性[14]，同時(shí)也可以通過(guò)MDR蛋白質(zhì)包裹腫瘤內(nèi)藥物，介導(dǎo)藥物的外派而降低藥效。研究表明，耐藥細(xì)胞株分泌的外泌體中的耐藥蛋白annexin A3和敏感株相比顯著增加[15]。MDR-associated ATP-binding cas-sette transporter(MDR-ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的激活介導(dǎo)藥物的外排[16]，是包括P-糖蛋白、MDR相關(guān)蛋白1和乳腺癌耐藥蛋白等一類(lèi)具有相同跨膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Ji等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以通過(guò)激活CaM-Ks/Raf/MEK/ERK 信號(hào)通路而影響胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu等化療藥物的敏感性。

綜上所述，腫瘤耐藥是一個(gè)多因素多步驟的過(guò)程，是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用的結(jié)果。本研究只是提示了外泌體在胃癌敏感細(xì)胞株SGC-7901的耐藥上發(fā)揮了作用，但是進(jìn)一步的機(jī)制尚在探索當(dāng)中。目前關(guān)于外泌體參與耐藥的研究已經(jīng)證實(shí)，但在體內(nèi)產(chǎn)生的影響仍然未知，需要我們進(jìn)一步去研究，這或可為腫瘤的化療耐藥提供新思路，成為化療耐藥的新靶點(diǎn)。

[1] Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide: Sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer,2015(5):E359-E386.

[2] Yu DD,Wu Y,Shen HY,et al. Exosomes in development,metastasis and drug resistance of breast cancer[J].Cancer Sci,2015,106(8):959-964.

[3] Yu S,Cao H,Shen B,et al.Tumor-derived exosomesrogression a in cancer p nd treatment failure[J].Oncotarget,2015,6(35):37151-37168.

[4] Xiao X,Yu S,Li S,et al.Exosomes: decreased sensitivity of lung cancer A549 cells to cisplatin[J].Plo S One,2014,9(2):e89534.

[5] Greenleaf EK,Hollenbeak CS,Wong J.Trends in the use and impact of neoadjuvant chemotherapy on perioperative outcomes for resected gastric cancer[J].Surgery,2015,159(4):1099-1112.

[6] 韓 勇,壽成超.影響5-FU療效的研究進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤臨床,2010,37(21):1255-1259.

[7] Lv MM,Zhu XY,Chen WX,et al.Exosomes mediate drug resistance transfer in MCF-7 breast cancer cells and a probable mechanism is delivery of P-glycoprotein[J].Tumor Biol,2014,35(11):10773-10779.

[8] Yang Y,Yang X,Yang Y,et al. Exosomes: A Promising Factor Involved in Cancer Hypoxic Microenvironments[J].Curr Med Chem,2015,22(36):4189-4195.

[9] Chen WX,Cai YQ,Lv MM,et al.Exosomes from docetaxel-resistant breast cancer cells alter chemosensitivity by delivering microRNAs [J].Tumour Biol,2014,35(10):9649-9659.

[10] Chen WX,Liu XM,Lv XM,et al. Exosomes from drug-resistant breast cancer cells transmit chemoresistance by a horizontal transfer of microRNAs[J]. Plo S One,2014,9(4):e95240.

[11] Chen WX,Zhong SL,Ji MH,et al.MicroRNAs delivered by extracellular vesicles: an emerging resistance mechanism for breast cancer[J].Tumor Biol,2014,35 (4):2883-2892.

[12] Challagundla KB,Wise PM,Neviani P,et al.Exosome-mediated transfer of microRNAs within the tumor microenvironment and neuroblastoma resistance to chemotherapy[J]. J Natl Cancer Inst,2015,107(7):pii:djv135.

[13] Liu D,Li C,Trojanowicz B,et al.CD97 promotion of gastric carcinoma lymphatic metastasis is exosome dependent[J].Gastric Cancer,2016,19(3):754-766.

[14] Baguley BC.Multiple drug resistance mechanisms in cancer[J].Mol Biotechnol,2010,46(3):308-316.

[15] Shedden K,Xie XT,Chandaroy P,et al.Expulsion of small molecules in vesicles shed by cancer cells: association with gene expression and chemosensitivity profiles[J].Cancer Res,2003,63(15):4331-4337.

[16] Jones PM,George AM.The ABC transporter structure and mechanism: perspectives on recent research[J].Cell Mol Life Sci,2004,61(6):682-699.

[17] Ji R,Zhang B,Zhang X,et al. J. Exosomes derived from human mesenchymal stem cells confer drug resistance in gastric cancer[J].Cell Cycle,2015,14(15):2473-2483.