閆怡軒 李偉忠

[摘要] 目的 研究選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布影響口腔癌耐長春新堿細(xì)胞株KB/VCR細(xì)胞對長春新堿敏感性的效應(yīng)，探討其作用機制。方法 采用MTT法分別檢測塞來昔布組、長春新堿組、塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+前列腺素E2（PGE2）組對KB/VCR細(xì)胞的生長抑制作用，用Western印跡法檢測P-糖蛋白（P-gp）、Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測塞來昔布對KB/VCR細(xì)胞凋亡的影響。采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 塞來昔布+長春新堿組的細(xì)胞生長抑制率高于塞來昔布組、長春新堿組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組（P<0.01）。塞來昔布+長春新堿組和塞來昔布組P-gp的表達(dá)顯著低于長春新堿組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組（P<0.01），塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組和塞來昔布組Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)顯著低于長春新堿組（P<0.01）。塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組細(xì)胞凋亡率均顯著高于長春新堿組、塞來昔布

組，塞來昔布+長春新堿+PGE2組細(xì)胞凋亡率顯著低于塞來昔布+長春新堿組（P<0.01）。結(jié)論 塞來昔布可以通過下調(diào)P-gp的表達(dá)及促進細(xì)胞凋亡，增強長春新堿耐藥株KB/VCR細(xì)胞對長春新堿的敏感性。

[關(guān)鍵詞] KB/VCR細(xì)胞； 多藥耐藥； P-糖蛋白； 環(huán)氧化酶-2抑制劑； 細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.018

口腔癌是常見的口腔頭頸部惡性腫瘤之一，近年來口腔癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯增高趨勢，已成為威脅人類健康的重要因素之一?；熓强谇话┲匾妮o助治療方法之一，目前化療所面臨的主要問題是癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降，導(dǎo)致多藥耐藥（multidrug resistant，MDR）的產(chǎn)生，使癌細(xì)胞產(chǎn)生

抵抗廣譜化療藥物的能力。

近來研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，選擇性環(huán)氧化酶-2（cycloxy-genase-2，COX-2）抑制劑可抑制許多類型癌細(xì)胞的生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強抗腫瘤藥物對癌細(xì)胞的毒性作用。COX-2抑制劑的抗腫瘤活性的作用機制包括抑制細(xì)胞分裂周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤新生血管生成等。此外有研究[4-5]認(rèn)為，COX-2抑制劑可以通過調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運家族中的膜轉(zhuǎn)運蛋白活性而增強腫瘤對化療藥物的敏感性。研究[6]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織內(nèi)COX-2與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達(dá)呈顯著性正相關(guān)。本課題組前期研究[7-8]也證實，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布可顯著增強順鉑對人舌癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞的生長抑制作用，增加耐長春新堿細(xì)胞株KB/VCR細(xì)胞內(nèi)化療藥物的蓄積[9]。本實驗研究塞來昔布對口腔上皮癌耐長春新堿細(xì)胞株KB/VCR化療敏感性的影響，探討塞來昔布增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

長春新堿（Vincristine，VCR）（Merck公司，德國），塞來昔布膠囊（Pfizer公司，美國），MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國），RPMI-1640、胎牛血清（Invitrogen公司，美國），P-gp、Bcl-2、Bcl-XL及β-肌動蛋白鼠抗人單克隆抗體、熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗（Epitomics公司，美國），人

口腔表皮樣癌耐長春新堿細(xì)胞株KB/VCR、人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、膜聯(lián)蛋白（annexin）V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒（南京凱基生物

科技發(fā)展有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

KB/VCR細(xì)胞用含有10%胎牛血清和200 nmol·L-1 VCR的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，KB細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測

將處于對數(shù)生長期的KB/VCR細(xì)胞，以每孔2×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后分別加入含10 μmol·L-1塞來昔布（塞來昔布組）、1.5 μmol·L-1長春新堿（長春新堿組）、10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿（塞來昔布+長春新堿

組）及10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿+100 μg·L-1前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）（塞

來昔布+長春新堿+PGE2組）的培養(yǎng)基，終液量為每孔200 μL，另外以未添加藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基作為空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，加入終質(zhì)量濃度1 g·L-1的MTT溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入150 μL DMSO，緩搖15 min，酶標(biāo)儀（EL×800型，BioTek公司，美國）490 nm波長下檢測光密度（optical density，OD）值。每孔設(shè)4個復(fù)孔，取其平均值，重復(fù)3次。按下述公式計算細(xì)胞生長抑制率：細(xì)胞生長抑制率=1-（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。用金正均法計算塞來昔布與長春新堿兩藥聯(lián)用后的合并效應(yīng)（q值）：q=EA+B /（EA+EB-EA·EB ）。其中EA代

表A藥單獨給藥時的效應(yīng)，EB代表B藥單獨給藥時的效應(yīng)，EA+B代表A、B兩藥合并給藥后的效應(yīng)，0.85≤q≤1.15為相加作用，q>1.15為協(xié)同作用，q<0.85為拮抗作用。

1.4 Western印跡法檢測細(xì)胞P-gp、Bcl-2、Bcl-XL

的表達(dá)

將KB/VCR細(xì)胞分別用含10 μmol·L-1塞來昔布（塞來昔布組）、1.5 μmol·L-1長春新堿（長春新堿組）、

10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿（塞來昔布+長春新堿組）及10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿+100 μg·L-1 PGE2（塞來昔布+長春新堿+

PGE2組）的培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。然后收集細(xì)胞并用冰PBS液洗滌3次。用含1%Triton X-100的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。收取總蛋白，按照常規(guī)的方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dod-

cyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜。一抗為鼠抗人P-gp單克隆抗體（1∶

1 000）、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體（1∶400）、鼠抗人Bcl-XL單克隆抗體（1∶400）、鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗

體（1∶2 000），二抗為熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1∶300），進行抗原抗體反應(yīng)，然后進行熒光顯色并測定反應(yīng)條帶灰度值，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，計算相對灰度值，重復(fù)3次。

收集相同數(shù)量的KB和KB/VCR細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜。一抗為鼠抗人P-gp單克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗體（1∶2 000），二抗為熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1∶300），進行抗原抗體反應(yīng)，然后進行熒光顯色并測定反應(yīng)條帶灰度值，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參，計算相對灰度值，重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的KB/VCR細(xì)胞按每毫升1×106個接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入含10 μmol·L-1塞來昔布（塞來昔布組）、1.5 μmol·L-1長春新堿（長春新堿組）、10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿（塞來昔布+長春新堿組）及10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿+100 μg·L-1 PGE2（塞來昔布+

長春新堿+PGE2組）的培養(yǎng)基10 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞后加入500 μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）懸浮細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V

熒光探針混勻，再加入5 μL碘化丙啶混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD法，方差不齊用Dunnett法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布聯(lián)合長春新堿對KB/VCR細(xì)胞的生長

抑制作用

MTT法檢測結(jié)果表明，作用KB/VCR細(xì)胞24、48、72 h后，塞來昔布+長春新堿組的細(xì)胞生長抑制率高于塞來昔布組、長春新堿組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組（P<0.01）（表1）。塞來昔布與長春新堿聯(lián)用在24、48、72 h時的q值分別為1.160、1.282、1.287，均為協(xié)同作用。這表明，塞來昔布聯(lián)合長春新堿可顯著增強長春新堿對KB/VCR的生長抑制作用。

2.2 P-gp、Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)

Western印跡檢測結(jié)果表明：1）塞來昔布+長春新堿組和塞來昔布組P-gp的表達(dá)顯著低于長春新堿組、對照組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組，塞來昔布+長春新堿+PGE2組P-gp的表達(dá)顯著低于長春新堿組和對照組（P<0.01）（圖1）；塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組和塞來昔布組Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)都顯著低于長春新堿組和對照組（P<0.01），塞

來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組和塞來昔布組之間Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)則無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）（圖2）。2）KB/VCR細(xì)胞P-gp的表達(dá)高于

KB細(xì)胞（P<0.01）（圖3）。

1：對照組；2：長春新堿組；3：塞來昔布組；4：塞來昔布+長春新堿組；5：塞來昔布+長春新堿+PGE2組。

2.3 塞來昔布對KB/VCR細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測表明：對照組、長春新堿組、塞來昔布組、塞來昔布+長春新堿組和塞來昔布+長春新堿+PGE2組的細(xì)胞凋亡率分別為3.84%±1.52%、13.61%±1.45%、24.73%±2.64%、58.07%±5.36%和41.74%±3.17%。塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組、長春新堿組、塞來昔布組（P<0.01）；塞來昔布+長春新堿+PGE2組細(xì)胞凋亡率顯著低于塞來昔布+長春新堿組（P<0.01）。

3 討論

化療是口腔癌的重要輔助治療方法之一，但是長期化療所導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)成為癌癥治療的主要障礙之一。癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生可能與外排泵的活性增加、藥物的吸收減少、解毒酶的激活、藥物作用靶點的改變以及細(xì)胞凋亡減少等有關(guān)[10]。

在人惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，P-gp的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性以及腫瘤患者的生存率成負(fù)相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織內(nèi)COX-2與P-gp的表達(dá)呈顯著性正相關(guān)。Nardone等[11]采用免疫組織化學(xué)方法在幽門螺桿菌陽性的胃癌患者中發(fā)現(xiàn)COX-2與P-gp表達(dá)顯著相關(guān)。Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)犬移行細(xì)胞癌中P-gp與COX-2的表達(dá)成正相關(guān)。Fantappiè等[13]也證實了COX-2與P-gp的表達(dá)存在相

關(guān)性，在多藥耐藥腫瘤細(xì)胞中兩者的表達(dá)都顯著增加。這些研究均證明，在多藥耐藥腫瘤組織中COX-2與P-gp的表達(dá)都顯著增強。本研究也證實，耐長春新堿細(xì)胞株KB/VCR細(xì)胞P-gp的表達(dá)顯著高于非耐藥細(xì)胞株KB細(xì)胞，這表明P-gp表達(dá)量的高低與細(xì)胞敏感性的產(chǎn)生具有正相關(guān)關(guān)系。本實驗進一步研究能否通過調(diào)控腫瘤組織中COX-2酶的活性進而調(diào)控P-gp的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性。

本研究證實，低濃度COX-2抑制劑10 μmol·L-1塞來昔布可明顯增強長春新堿對KB/VCR細(xì)胞的生長抑制作用，經(jīng)塞來昔布處理后的KB/VCR細(xì)胞與未經(jīng)塞來昔布處理的相比，P-gp的表達(dá)量明顯降低。這提示COX-2抑制劑塞來昔布對KB/VCR細(xì)胞P-gp的表達(dá)具有明顯的抑制作用。經(jīng)過加入外源性的PGE2后，P-gp的表達(dá)量增加。因此，塞來昔布能通過抑制P-gp的表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)長春新堿蓄積增多、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加，進而增加長春新堿對KB/VCR的細(xì)胞毒性作用，而塞來昔布抑制P-gp表達(dá)的途徑在一定程度上是通過PGE2途徑實現(xiàn)的。有關(guān)COX-2抑制劑調(diào)節(jié)P-gp表達(dá)的機制尚需進一步的研究。目前認(rèn)為MDR-1基因啟動子可能含有激活蛋白1（activator pro-tein-1，AP-1）和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）結(jié)合位點，這可能與MDR-1基因的表達(dá)有關(guān)。

Tegeder等[14]研究證實，非類固醇抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drags，NSAIDS）如布洛芬可通過

COX-2依賴途徑直接抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB，下調(diào)相關(guān)基因如COX-2或腫瘤壞死因子（tumor ne-

crosis factor，TNF-α）等的表達(dá)來抑制炎癥過程。另外有研究[15]發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可以通過抑制轉(zhuǎn)錄因子

AP-1和NF-κB的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞P-gp的表達(dá)。

Bcl-2、Bcl-XL是Bcl-2家族中一類抗凋亡的細(xì)胞死亡負(fù)調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞受到外界刺激時能保護細(xì)胞免于凋亡[16-17]。Fantappiè等[13]研究證實，塞來昔布可通過下調(diào)Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)促進耐藥肝癌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果與之相一致，塞來昔布具有誘導(dǎo)及促進長春新堿誘導(dǎo)KB/VCR細(xì)胞凋亡的作用。塞來昔布聯(lián)合長春新堿處理細(xì)胞后，KB/VCR細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)明顯減少。其機制可能與以下兩方面有關(guān)，一是P-gp表達(dá)的降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)長春新堿的濃度增高，促進了長春新堿對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；二是塞來昔布處理細(xì)胞后抑制了Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)，從而促進細(xì)胞的凋亡。但是塞來昔布抑制Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)的途徑尚不確定，實驗中加入外源性的PGE2后并不能使Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)增加，因此塞來昔布下調(diào)KB/VCR細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)可能是通過非PGE2依賴途徑實現(xiàn)的。

本研究結(jié)果表明，塞來昔布可以增強長春新堿對KB/VCR細(xì)胞的毒性作用，這種作用與抑制P-gp的表達(dá)和促進細(xì)胞凋亡有關(guān)，為進一步理解COX-2在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生及其COX-2抑制劑增強腫瘤細(xì)胞化療敏感性的機制提供幫助。

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（本文編輯 李彩）