董強(qiáng) 夏茜 周建獎(jiǎng)等

[摘要] 目的 研究流體切應(yīng)力條件下大鼠破骨細(xì)胞碳酐酸酶Ⅱ（CaⅡ）mRNA的表達(dá)變化，探討應(yīng)力環(huán)境下大鼠

破骨細(xì)胞的功能活動(dòng)情況。方法 采用1，25-（OH）2D3/地塞米松誘導(dǎo)SD大鼠骨髓細(xì)胞，抗酒石酸酸性磷酸酶染色和掃描電鏡鑒定破骨細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）進(jìn)行細(xì)胞純化。對(duì)破骨細(xì)胞施加不同力值和作用

時(shí)間的流體切應(yīng)力，采用實(shí)時(shí)熒光定量巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)CaⅡ mRNA的表達(dá)。結(jié)果 隨著力值的增加和作用時(shí)間的延長，破骨細(xì)胞CaⅡ mRNA的表達(dá)量分別呈下降趨勢(shì)（P<0.05）。結(jié)論 在一定范圍的流體切應(yīng)

力作用下，破骨細(xì)胞CaⅡ mRNA的表達(dá)受到抑制，表達(dá)水平與力值大小和加載時(shí)間分別存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 破骨細(xì)胞； 流體切應(yīng)力； 骨吸收； 碳酐酸酶Ⅱ； 聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號(hào)] R 318.01 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.023

功能載荷下的種植體與周圍骨組織形成和保持良好的骨性界面，是口腔種植義齒長期成功使用的關(guān)鍵要素。在復(fù)雜的咬合力和肌力等各種力學(xué)環(huán)境下，種植體周圍的骨組織不斷進(jìn)行改建。在各種應(yīng)力環(huán)境下，骨組織和骨細(xì)胞發(fā)生骨吸收和骨形成的機(jī)制仍未能完全明確。骨吸收是多階段的過程。破骨細(xì)胞首先通過泌酸使骨組織脫礦，然后降解有機(jī)質(zhì)。碳酐酸酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ，CaⅡ）催化CO2水解成碳酸氫鹽和氫離子，為泌酸提供主要的質(zhì)子來源，在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的胞內(nèi)pH值和在胞外不同的pH值水平促進(jìn)吸收的活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-2]。

目前，對(duì)流體切應(yīng)力作用下大鼠破骨細(xì)胞CaⅡ表達(dá)水平的相關(guān)研究報(bào)道很少。本研究采用平行平板流體切應(yīng)力加載裝置，對(duì)純化后的SD大鼠破骨細(xì)胞施加不同力值和作用時(shí)間的流體切應(yīng)力，采用實(shí)時(shí)熒光定量巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)CaⅡ mRNA的表達(dá)水平，探討應(yīng)力環(huán)境下大鼠破骨細(xì)胞功能活動(dòng)的變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（清潔級(jí)，貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）；

α-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hy-clone公司，美國）；地塞米松、1，25-（OH）2D3、青霉素-鏈霉素（Sigma公司，美國）；Trizol Reagent、

SupperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNase Ⅰ（Invitrogen公司，美國）；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reac-tion，PCR）試劑（MBI公司，立陶宛）；引物及Taqman熒光探針（上海閃精生物制劑有限公司）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日

本）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；除

菌過濾器（Gibco公司，美國）；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；FTC2000熒光定量PCR儀（楓嶺公司，加拿大）；流體切應(yīng)力加力系統(tǒng)

（專利號(hào)：200420034438）。

1.2 方法

1.2.1 破骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定和純化 以1，25-（OH）2D3/地塞米松誘導(dǎo)10～12 d齡SD大鼠四肢長骨骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)第7天，通過抗酒石酸酸性磷酸酶（tar-

trate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色[3]和掃

描電鏡（scanning electron microscope，SEM）鑒定破骨

細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸（ethy-

lenediamine tetraacetic acid，EDTA）進(jìn)行細(xì)胞純化[4]。

1.2.2 破骨細(xì)胞的體外加力 按加力時(shí)間和力值大小的不同，分為2組，具體如下。1）力值組：分別對(duì)純化后的破骨細(xì)胞施加0（對(duì)照組）、0.9、3.2、8.9、

18.7 dyne·cm-2的流體切應(yīng)力，時(shí)間為30 min；2）時(shí)

間組：分別對(duì)純化后的破骨細(xì)胞施加3.2 dyne·cm-2的流體切應(yīng)力，時(shí)間各為0（對(duì)照組）、15、30、60 min。

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。呈單層排列的細(xì)胞受到切應(yīng)力的計(jì)算公式為[5]：τ=6μQ/wh2。其中μ為培養(yǎng)基表觀黏

度，Q為流量，w為流槽寬度，h為流槽高度。由血液流變儀測(cè)出α-MEM培養(yǎng)基37 ℃時(shí)μ=0.752×10-3 Pa·s。在實(shí)驗(yàn)加力結(jié)束時(shí)用秒表和量筒測(cè)量培養(yǎng)基流量。

將流體切應(yīng)力加力裝置[6]按設(shè)計(jì)要求安裝。系統(tǒng)中加入無血清的α-MEM培養(yǎng)液（37 ℃）200 mL，啟動(dòng)

蠕動(dòng)泵，保持蠕動(dòng)泵提供的流量恒定（約50 mL·min-1）。培養(yǎng)7 d的破骨細(xì)胞純化后，將載玻片放入流室的矩形流槽內(nèi)，按分組情況分別對(duì)純化后的破骨細(xì)胞施加流體切應(yīng)力。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量巢式RT-PCR 采用Trizol法提取樣本總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒建立反應(yīng)體系，合成cDNA。根據(jù)Genebank中檢索到的CaⅡ mRNA基因全序列，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行CaⅡ mRNA內(nèi)、外側(cè)引物和管家基因GAPDH的Taqman探針的設(shè)計(jì)（表1）。引物和探針由上海生物公司合成并檢測(cè)。將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR，第一輪PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸40 s，循環(huán)15次；72 ℃延伸5 min。第二輪PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸

5 min。對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，檢驗(yàn)引物設(shè)計(jì)合成無誤后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液3 μL、25 mmol·L-1 MgCl2 3 μL、25 mmol·L-1 dNTPs 0.36 μL、10 μmol·L-1 CaⅡ內(nèi)側(cè)上下游引物各1 μL、10 μmol·L-1 GAPDH探針

1 μL、5 U·μL-1 Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.34 μL、巢式PCR產(chǎn)物5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s，循環(huán)45次。

將PCR儀的熒光采集時(shí)間統(tǒng)一設(shè)定在擴(kuò)增反應(yīng)的延伸期。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將采集到的每一循環(huán)反應(yīng)時(shí)的各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長指數(shù)進(jìn)行分析，繪制相應(yīng)的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定每個(gè)樣品管中熒光強(qiáng)度增加到閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct值），根據(jù)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)模板初始拷貝的對(duì)數(shù)

值作圖，得出該樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在此反應(yīng)系統(tǒng)中，熒光強(qiáng)度的增加與模板量的增加成正比，熒光強(qiáng)度的變化可反應(yīng)模板產(chǎn)物量的變化。

根據(jù)熱循環(huán)儀檢測(cè)到反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度，確定Ct值，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CaⅡ和管家基因GAPDH的Ct值。假設(shè)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組中CaⅡ的相對(duì)表達(dá)量為Z，并根據(jù)公式計(jì)算Z=2-△△Ct，△△Ct=（CtCaⅡ-CtGAPDH）實(shí)驗(yàn)組-（CtCaⅡ-CtGAPDH）對(duì)照組[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組相對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化和鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見，多核破骨樣細(xì)胞呈煎蛋形、漏斗形等不規(guī)則形態(tài)，有偽足和絲狀突起，可含數(shù)十個(gè)細(xì)胞核，核在細(xì)胞內(nèi)分布無規(guī)律。在細(xì)胞培養(yǎng)7 d時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化6～8 min后，載玻片上大部分單核細(xì)胞脫落，純化率可達(dá)90%（圖1）。TRAP染色的多核破骨樣細(xì)胞胞漿呈紅色陽性反應(yīng)，胞核陰性（圖2）。SEM觀察可見，

吸收陷窩呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，邊界清晰，底面粗糙，有纖維樣基底（圖3）。

2.2 RNA分析和擴(kuò)增效率分析

提取的總RNA行1%瓊脂糖凝膠電泳，28S、18S條帶清晰可見，無DNA污染條帶，無明顯降解條帶。常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，CaⅡ和GAPDH條帶清晰，未見明顯的雜帶，相應(yīng)的堿基數(shù)目正確（圖4）。

以樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，分別擬合CaⅡ和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。其回歸

系數(shù)均大于0.96，擬合滿意。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線以公式計(jì)算擴(kuò)增效率Ex[7]：Ex=101/-k（k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率），CaⅡ與GAPDH的Ex值近似相同，約為2.1。

2.3 不同流體切應(yīng)力作用下CaⅡ mRNA的表達(dá)

力值組中，施加0、0.9、3.2、8.9、18.7 dyne·cm-2流體切應(yīng)力后CaⅡ mRNA相對(duì)拷貝數(shù)分別為（1 000±0.00）×10-3、（18.98±17.02）×10-3、（0.98±0.00）×10-3、（0.31±0.19）×10-3、（0.02±0.00）×10-3。各加力樣本CaⅡmRNA的相對(duì)拷貝數(shù)均比對(duì)照組（0 dyne·cm-2）低。隨著力值的增加，各組樣本CaⅡ mRNA相對(duì)拷貝數(shù)的均數(shù)值逐漸減少，組間存在顯著性差異（P<0.05）。

在時(shí)間組中，施加流體切應(yīng)力0、15、30、60 min后CaⅡ mRNA相對(duì)拷貝數(shù)分別為（1 000±0.00）×10-3、（78.15±46.85）×10-3、（0.98±0.00）×10-3、（0.55±0.43）×10-3。各加力樣本CaⅡ mRNA的相對(duì)拷貝數(shù)均比對(duì)照組（0 min）低。隨著加力時(shí)間的延長，各組樣本CaⅡ mRNA相對(duì)拷貝數(shù)的均數(shù)值逐漸減少，組間存在顯著性差異（P<0.05）。

3 討論

維持局部酸性微環(huán)境是破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能的重要條件。CaⅡ?qū)俸\金屬酶家族，分布廣泛，幾乎在所有組織或器官的某些細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(dá)。在破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，通過與HCO3-/Cl-交換的聯(lián)合作用，CaⅡ?yàn)榫S持破骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)pH提供了主要的質(zhì)子來源[8]，而破骨細(xì)胞外pH的降低也可能

增強(qiáng)CaⅡ的表達(dá)。CaⅡ表達(dá)受到抑制，將直接影響破骨細(xì)胞的骨吸收活性。

在體外流體的相關(guān)研究中，由于應(yīng)用不同的基底、流室腔、細(xì)胞準(zhǔn)備的差異（有無血清、營養(yǎng)、融合等）等因素而復(fù)雜化[9]。除了切應(yīng)力的性質(zhì)和大小，流體的空間分布也對(duì)其效應(yīng)有重要的影響[10]。平行

平板流動(dòng)腔提供的切應(yīng)力可以人為的控制，量化較準(zhǔn)確，使各種細(xì)胞的體外流體力學(xué)研究相對(duì)容易和可行。但由于流室腔的幾何結(jié)構(gòu)與骨組織的陷窩-小管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)不同，流體的空間分布也不同，其介導(dǎo)的切應(yīng)力的效應(yīng)可能與體內(nèi)有差異。建立可量化的模擬陷窩-小管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，將有力地促進(jìn)骨細(xì)胞相關(guān)流體力學(xué)的研究，也是骨改建機(jī)制研究的努力方向之一。

本實(shí)驗(yàn)采用平行平板流體切應(yīng)力加載系統(tǒng)，以無血清的α-MEM培養(yǎng)基作為流動(dòng)介質(zhì)，對(duì)胰蛋白酶/EDTA消化法純化后的1，25-（OH）2D3/地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠破骨細(xì)胞，施加不同力值和作用時(shí)間的流體切應(yīng)力，用實(shí)時(shí)熒光定量巢式RT-PCR檢測(cè)CaⅡ mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著力值的增加和作用時(shí)間的延長，CaⅡ mRNA的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，各組樣本間存在顯著性差異（P<0.05）。說明在一定范

圍內(nèi)的穩(wěn)定流體切應(yīng)力（0.9～18.7 dyne·cm-2，30 min；

3.2 dyne·cm-2，15～60 min）作用下，破骨細(xì)胞CaⅡ

mRNA的表達(dá)受到抑制，并且表達(dá)水平與力值的大小和加載時(shí)間分別存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道的作用趨勢(shì)一致，提示流體切應(yīng)力不僅抑制破骨細(xì)胞的形成[11]，還可能通過改變其胞

內(nèi)關(guān)鍵的功能性酶（如CaⅡ）的轉(zhuǎn)錄水平而影響骨吸收，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Schwartz GJ， Brown D， Mankus R， et al. Low pH enhances ex-

pression of carbonic anhydrase II by cultured rat inner medullary

collecting duct cells[J]. Am J Physiol， 1994， 266（2 Pt 1）：C508-

C514.

[2] Meghji S， Morrison MS， Henderson B， et al. pH dependence of

bone resorption： Mouse calvarial osteoclasts are activated by aci-

dosis[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2001， 280（1）：E112-

E119.

[3] Mostafa YA， Meyer RA Jr， Latorraca R. A simple and rapid me-

thod for osteoclast identification using a histochemical method for

acid phosphatase[J]. Histochem J， 1982， 14（3）：409-413.

[4] 董強(qiáng)， 梁星， 陳悅， 等. 胰酶消化法純化誘導(dǎo)不同年齡段SD大鼠

骨髓破骨細(xì)胞的體位培養(yǎng)[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2006， 24（4）：

350-352， 361.

Dong Qiang， Liang Xing， Chen Yue， et al. Isolation of bone mar-

row-derived rat osteoclast-like cells with the digestion of trypsin

[J]. West China J Stomatol， 2006， 24（4）：350-352， 361.

[5] Frangos JA， McIntire LV， Eskin SG. Shear stress induced stimu-

lation of mammalian cell metabolism[J]. Biotechnol Bioeng， 1988，

32（8）：1053-1060.

[6] 陳明， 梁星， 王魏新， 等. 可用于體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的流體剪應(yīng)

力系統(tǒng)[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志， 2005， 22（2）：288-292.

Chen Ming， Liang Xing， Wang Weixin， et al. A biomechanical

system that can apply fluid shear stress to osteoclast-like cells in

vitro[J]. J Biomed Eng， 2005， 22（2）：288-292.

[7] Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data

using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））

Method[J]. Methods， 2001， 25（4）：402-408.

[8] Oksala N， Levula M， Pelto-Huikko M， et al. Carbonic anhydrases

Ⅱ and ⅩⅡ are up-regulated in osteoclast-like cells in advanced

human atherosclerotic plaques-Tampere Vascular Study[J]. Ann

Med， 2010， 42（5）：360-370.

[9] Stevens HY， Frangos JA. Bone cell responses to fluid flow[J]. Me-

thods Mol Med， 2003， 80：381-398.

[10] Balcells M， Fernández Suárez M， Vázquez M， et al. Cells in flui-

dic environments are sensitive to flow frequency[J]. J Cell Physiol，

2005， 204（1）：329-335.

[11] Kulkarni RN， Bakker AD， Everts V， et al. Inhibition of osteo-

clastogenesis by mechanically loaded osteocytes： Involvement of

MEPE[J]. Calcif Tissue Int， 2010， 87（5）：461-468.

（本文編輯 杜冰）