李厚忠，郭金興，張勝?gòu)?qiáng)，張羽飛

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011）

酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（acidic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-1）是一種廣泛存在于人體各組織中的具有多方面功能的生物活性蛋白，其在組織形態(tài)的發(fā)生、發(fā)展，血管生成以及創(chuàng)傷愈合等諸多方面發(fā)揮著十分重要的作用[1]。同時(shí)，F(xiàn)GF-1也是成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角膜細(xì)胞、心肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等生長(zhǎng)的刺激因子[2]。研究表明[3]，F(xiàn)GF-1可緩解心肌短暫缺血引起的心肌梗死和心律失常等臨床癥狀。也有研究表明[4]，對(duì)于由缺血造成心肌的損傷（缺血-再灌注損傷），F(xiàn)GF-1可通過(guò)增加血管生成發(fā)揮心肌保護(hù)作用。但是，有關(guān)于FGF-1是否具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用體外培養(yǎng)心肌H9c2細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡模型，觀察FGF-1對(duì)H9c2細(xì)胞存活率，凋亡指數(shù)以及凋亡相關(guān)酶半胱氨酸蛋白 酶 -3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3），半胱氨酸蛋白酶-8（cysteinyl aspartate specific proteinase-8，Caspase-8）和半胱氨酸蛋白酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）表達(dá)的影響，探討FGF-1抗H9c2細(xì)胞凋亡作用及可能的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

心肌細(xì)胞株H9c2（中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)），F(xiàn)GF-1（美國(guó)R&D system公司），肝素（Heparin，美國(guó) Sigma公司），TGF-β1（美國(guó) PEPROTECH 公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，美國(guó)Amresco公司），DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物有限公司），DAPI（上海碧云天公司），兔抗人caspase-3單克隆抗體、兔抗人caspase-8單克隆抗體和兔抗人caspase-9單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），HRP標(biāo)記抗鼠IgG二抗（上海碧云天公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、200 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/ml硫酸鏈霉素、100 u/ml青霉素鈉）中，37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待細(xì)胞達(dá)80%匯合度時(shí)，傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色分析檢測(cè)H9c2細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μl，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄上清，參照文獻(xiàn)[5]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TGF-β1模型組每孔加入DMEM培養(yǎng)基，Heparin組每孔加入100μg/ml Heparin，F(xiàn)GF-1組每孔加入20 ng/ml FGF-1，F(xiàn)GF-1/Heparin組每孔加入20 ng/ml FGF-1和100μg/ml Heparin，正常對(duì)照組每孔加入DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)平行孔。37℃、5%CO2及飽和濕度下分別培養(yǎng)12 h，棄上清。正常對(duì)照組每孔加入DMEM培養(yǎng)基，其余各組均每孔加入20 ng/ml TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，各組每孔加入MTT溶液（0.5 mg/ml）20μl，37℃、5% CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 min。Rayto RT-6100酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%，取6孔平均值。

1.2.3 TUNEL染色檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡 使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響。給藥及分組方法同“1.2.2”，PBS沖洗2次，每次 3 min，然后-20℃甲醇固定15 min。PBS沖洗3次，每次3 min，加入50μl TUNEL反應(yīng)液，避光37℃孵育1 h。PBS沖洗2次，每次3 min，Hoechst 33258染料37℃避光染色10 min。Olympus BX43熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)。每個(gè)圖片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，計(jì)算凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI），AI（%）=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 給藥及分組方法同“1.2.2”，加入含有25 mmol/L HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF和1μg/ml亮肽素的冰冷的裂解緩沖液（pH=7.4），10 000 r/min 4℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30μg蛋白上樣后進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳。當(dāng)電泳完成后，電轉(zhuǎn)至0.45μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉PBST 4℃封閉2 h。然后加入兔抗人caspase-3單克隆抗體，兔抗人caspase-8單克隆抗體，兔抗人caspase-9單克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌后，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔第二抗體（1∶500稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h。PBST洗滌3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行計(jì)值及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。β-actin抗體孵育方法與上述方法相同，蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白表達(dá)水平/β-actin蛋白表達(dá)水平。每份樣品檢測(cè)6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較，采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞存活率的影響

MTT比色分析結(jié)果顯示，模型組H9c2細(xì)胞存活率降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；FGF-1組 和 FGF-1/Heparin組 H9c2細(xì)胞存活率升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)GF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。見(jiàn)圖1。

2.2 FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，模型組H9c2細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；FGF-1組 和 FGF-1/Heparin組 H9c2細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)GF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡具有抑制作用。見(jiàn)圖2。

2.3 FGF-1對(duì)TGF-β1誘 導(dǎo) 的H9c2細(xì) 胞Caspase-3、Caspase-8和 Caspase-9表達(dá) 的影響

Western blot結(jié)果顯示，模型組H9c2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；FGF-1組和FGF-1/Heparin組H9c2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)GF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)具有抑制作用。見(jiàn)圖3。

圖1 FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞存活率的影響

圖2 FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞調(diào)亡的影響

圖3 FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)的影響

3 討論

FGF是一類(lèi)多肽類(lèi)物質(zhì)，其中大多數(shù)成員可與肝素結(jié)合發(fā)揮作用，單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞效果一般。因此，一般使用肝素與FGF-1一起作用，提高FGF-1的藥效[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-1可提高H9c2細(xì)胞的存活率，F(xiàn)GF-1對(duì)H9c2細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是指發(fā)生在生理狀態(tài)下的細(xì)胞程序性死亡，其特點(diǎn)是不發(fā)生炎癥反應(yīng)。本研究TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡具有抑制作用。細(xì)胞凋亡受分子水平的調(diào)控[7]，為探討FGF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞抗凋亡的可能機(jī)制，本研究對(duì)Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9進(jìn)行了檢測(cè)。Caspases是在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的酶家族，是細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，激活或超量表達(dá)均會(huì)引起細(xì)胞凋亡，又稱(chēng)凋亡蛋白酶，對(duì)凋亡起關(guān)鍵作用[8]。有研究表明[9]，細(xì)胞的凋亡是由于Caspase逐步發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的。Caspase-3位于Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，被認(rèn)為是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡真正的實(shí)施者[10]。經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑分為2條，包括細(xì)胞外途徑和細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑[11]。在細(xì)胞外途徑過(guò)程中，死亡配體和相對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合形成死亡信號(hào)，接著再與信號(hào)傳導(dǎo)分子相連接，進(jìn)一步和Caspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，從而使Caspase-8活化，當(dāng)Caspase-8直接與Caspase-3發(fā)生作用，Caspase-3被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。而細(xì)胞內(nèi)途徑也稱(chēng)為線粒體途徑，在此途徑中，凋亡刺激因子與凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，APAF1）形成多聚復(fù)合物，然后胞質(zhì)中的Caspase-9前體結(jié)合，形成巨大復(fù)合物，巨大復(fù)合物引起Caspase-9前體活化，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，從而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。心肌細(xì)胞的凋亡作用可能是非缺血和/或缺血性心肌病患者心肌細(xì)胞死亡的一種形式。一旦心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，原有的心肌即被膠原纖維所取代，繼而心肌就會(huì)進(jìn)一步發(fā)生纖維化、肥厚、心室重構(gòu)等，最終發(fā)展至心力衰竭[14]。因此，有關(guān)于心肌細(xì)胞的凋亡作用及機(jī)制越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。研究表明，TGF-β1是在HF過(guò)程中急劇增加的細(xì)胞因子中的一員，心肌細(xì)胞在TGF-β1的刺激下可發(fā)生細(xì)胞凋亡，TGF-β1作為導(dǎo)致心肌纖維化諸多因素最后的共同中介之一，被認(rèn)為是影響心肌纖維化最直接，也是最重要的細(xì)胞因子[15]。本研究Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達(dá)也具有抑制作用。以上結(jié)果提示，F(xiàn)GF-1可能通過(guò)抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)從而對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞具有抗凋亡作用。

終 上 所 述，F(xiàn)GF-1對(duì)TGF-β1誘 導(dǎo) 的H9c2心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其機(jī)制可能與抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)有關(guān)。

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