，， ，

(1. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2.河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450003； 3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300070)

核因子-κB抑制物激酶ε(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit epsilon，IKKε) 是IKK家族成員，可以通過(guò)核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路調(diào)控腫瘤的侵襲和遷移能力[1]。研究[2-4]表明，IKKε在人腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并與病理分級(jí)相關(guān)，抑制IKKε表達(dá)后，可顯著降低膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移能力。但I(xiàn)KKε通過(guò)IKKε-YAP1-miR-Let-7b/i途徑促進(jìn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性進(jìn)展的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在U87-MG細(xì)胞中分別調(diào)控IKKε及YAP1的表達(dá)水平，進(jìn)而檢測(cè)IKKε、YAP1及miR-Let-7b/i的表達(dá)水平，以探究IKKε通過(guò)IKKε-YAP1-miR-Let-7b/i途徑促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性進(jìn)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑IKKε短發(fā)夾核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid，shRNA)慢病毒序列為5′-GCATCATCGAACGGCTAAATA-3′，無(wú)義序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′，由上海吉?jiǎng)P公司合成；YAP1小干擾RNA(small interfere ribonucleic acid，siRNA)由廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成；IKKε上游引物為5′-GAGAAGTTCGTCTCGGTCTATGG-3′,下游引物5′-TGCATGGTACAAGGTCACTCC-3′；YAP1上游引物為5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′,下游引物5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-Let-7b/i及U6反轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物均由廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成；人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87-MG購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，RT-PCR定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或抗鼠二抗及小鼠抗GAPDH抗體(北京中杉金橋生物工程有限公司)，抗IKKε抗體、抗YAP1抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、病毒轉(zhuǎn)染和siRNA轉(zhuǎn)染U87-MG細(xì)胞采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前以3×105個(gè)/孔種于6孔板內(nèi)，加2 mL完全培養(yǎng)基，過(guò)夜。次日稀釋病毒，按1 μL/孔IKKε shRNA慢病毒原液稀釋至6 mL完全培養(yǎng)基中并添加終濃度為5 μg·mL-1的聚凝胺，移去孔中培養(yǎng)基，按1 mL/孔添加稀釋后的病毒液，同時(shí)建立對(duì)照，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，24 h后移去病毒液，加入2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度至70%～80%時(shí)，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行YAP1 siRNA轉(zhuǎn)染，同時(shí)建立對(duì)照。

1.3Westernblot檢測(cè)IKKε與YAP1表達(dá)RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰浴90 V轉(zhuǎn)膜90 min。室溫封閉2 h，一抗(IKKε 11 000稀釋?zhuān)琘AP1 11 000稀釋?zhuān)珿APDH 11 000稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜，次日室溫復(fù)溫1 h后，PBST洗5 min，3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBST洗5 min，3次，將發(fā)光液加至聚偏氟乙烯膜上，曝光，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.4RT-PCR檢測(cè)IKKε、YAP1及miR-Let-7i/b表達(dá)Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA， RT-PCR擴(kuò)增，以GAPDH、U6為參照。擴(kuò)增體系20 μL，包括PCR buffer 10 μL，雙蒸水7 μL，目的基因合成引物2 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，55 ℃、40 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)果判定采用2-ΔΔCT法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算IKKε、YAP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平;以U6為內(nèi)參照，計(jì)算miR-Let-7i/b的相對(duì)表達(dá)水平。各組均設(shè)復(fù)孔3個(gè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力Transwell上室中加入13(基質(zhì)膠DMEM)稀釋的基質(zhì)膠60 μL，37 ℃下30 min使其凝膠。下室加入600 μL含血清培養(yǎng)基。待檢細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，上室中加入5×104個(gè)細(xì)胞，24 h后棄上室液體，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定15 min，棉簽擦去上室未過(guò)膜細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10 s，倒置上室顯微鏡下觀察成像。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染IKKεshRNA對(duì)YAP1及miR-Let-7b/i表達(dá)的影響與對(duì)照組和無(wú)義序列組相比較，轉(zhuǎn)染IKKε shRNA組IKKε蛋白及mRNA水平明顯降低，YAP1蛋白水平明顯降低，miR-Let-7b/i水平明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2YAP1抑制miR-let-7b/i表達(dá)與對(duì)照組和無(wú)義序列組相比較，轉(zhuǎn)染YAP1 siRNA組YAP1蛋白及mRNA水平明顯降低；miR-Let-7b/i水平明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3轉(zhuǎn)染IKKεshRNA抑制細(xì)胞遷移和侵襲情況與對(duì)照組和無(wú)義序列組相比較，轉(zhuǎn)染IKKε shRNA組穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)明顯降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 U87-MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染IKKε shRNA慢病毒后IKKε、YAP1及miR-Let-7b/i水平變化

A、B：轉(zhuǎn)染IKKε shRNA慢病毒后，IKKε蛋白及mRNA水平的變化；C、D：轉(zhuǎn)染IKKε shRNA慢病毒后，YAP1蛋白及mRNA水平的變化；E、F：轉(zhuǎn)染IKKε shRNA慢病毒后，miR-Let-7b/i表達(dá)水平的變化

圖2 U87-MG細(xì)胞轉(zhuǎn)染YAP1 siRNA后YAP1及miR-Let-7b/i水平變化

A、B：轉(zhuǎn)染YAP1 siRNA后YAP1蛋白及mRNA水平的變化；C、D：轉(zhuǎn)染YAP1 siRNA后，miR-Let-7b/i表達(dá)水平的變化

3 討論

IKKε在膠質(zhì)瘤中明顯高表達(dá)，并與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)有關(guān)[5]。IKKε可體外調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值、遷移和侵襲，并在體內(nèi)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的形成[3, 5]。IKKε主要影響NF-κB等通路[6-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IKKε能調(diào)控YAP1的表達(dá)，而YAP1是Hippo通路下游的重要因子,并且YAP1入核可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[11]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低IKKε后YAP1的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，而蛋白水平明顯降低，說(shuō)明IKKε調(diào)節(jié)YAP1不是在轉(zhuǎn)錄水平，而是在轉(zhuǎn)錄后的翻譯修飾水平。

YAP1是重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要通過(guò)Hippo通路發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用[12-13]。研究[14-17]表明，LIN28是一種RNA結(jié)合蛋白，可結(jié)合miR-Let-7家族前體的終端環(huán)，阻斷其成熟，因此增強(qiáng)致癌性。Chaulk等[18]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中YAP1能通過(guò)調(diào)節(jié)LIN28-Let-7軸降低成熟Let-7的表達(dá)，但抑制YAP1的表達(dá)可降低LIN28的蛋白量，而其mRNA無(wú)明顯改變，由此說(shuō)明YAP1調(diào)控LIN28是通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾。因此,YAP1調(diào)控miR-Let-7表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄后，而不是在轉(zhuǎn)錄水平。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)敲低YAP1后檢測(cè)miR-Let-7b/i的變化證明了這個(gè)結(jié)論。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A、B：Transwell上室未加基質(zhì)膠條件下，各組細(xì)胞穿膜情況(×200)，反映各組細(xì)胞遷移能力情況；C、D：Transwell上室加基質(zhì)膠條件下，各組細(xì)胞穿膜情況(×200)，反映各組細(xì)胞侵襲能力情況

在多種類(lèi)型腫瘤中，發(fā)現(xiàn)miR-Let-7家族是重要的腫瘤抑制因子，miR-Let-7能夠通過(guò)多種通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲。Johnson等[19]研究發(fā)現(xiàn)ras基因包括H-ras、K-ras和N-ras，在細(xì)胞進(jìn)程中這些因子都受miR-Let-7負(fù)調(diào)控。Shi等[20]研究報(bào)道高遷移率族蛋白A2是癌基因，在子宮平滑肌肉瘤中是miR-Let-7的下游靶基因。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)miR-Let-7a通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3影響肝癌的發(fā)生?？傊?，這些研究數(shù)據(jù)表明miR-Let-7家族在惡性腫瘤中扮演重要角色。因此，miR-Let-7b/i可能成為靶向治療膠質(zhì)瘤的新的靶點(diǎn)。

綜上所述，敲低IKKε后可降低YAP1蛋白表達(dá)，但是不影響YAP1 mRNA的表達(dá)，增加miR-Let-7b/i的表達(dá)。然后，關(guān)于YAP1對(duì)miR-Let-7b/i的影響的研究顯示，敲低YAP1后miR-Let-7b/i表達(dá)升高。因此，IKKε可通過(guò)IKKε-YAP1-miR-let-7b/i通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展，阻礙該通路可能是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種新的治療策略。