唐 朋 ，凌笑笑，梁春年，吳曉云，褚 敏，王宏博，閻 萍*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；3.甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050）

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成熟的精子是基因轉(zhuǎn)錄停止的細(xì)胞，幾乎不存在mRNA[1]。但近年來(lái)，聚焦于精子RNA的表達(dá)研究及cDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，成熟精子中存在大量編碼與非編碼RNA，這些RNA的種類(lèi)和轉(zhuǎn)錄功能復(fù)雜，參與調(diào)控精子受精、獲能及胚胎的早期發(fā)育等生理過(guò)程[2-4]。因此，分析和研究精子RNA是了解受精及胚胎早期發(fā)育中遺傳信息傳遞的重要途徑，有助于提高動(dòng)物的繁殖性能。但由于精子細(xì)胞核被一薄層細(xì)胞質(zhì)覆蓋以及RNA含量極微等自身特征的限制，需要優(yōu)化提取方法才能獲得高質(zhì)量的精子RNA。目前，人、牛、豬等動(dòng)物精子RNA提取已有報(bào)道[5-7]，但對(duì)牦牛精子的研究卻很少。本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，以牦牛精液為研究對(duì)象，通過(guò)3種方法對(duì)RNA提取進(jìn)行探索研究，為后續(xù)研究精子的基因表達(dá)及功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與精子采集 選擇3頭健康、繁殖能力正常的大通牦牛種公牛的細(xì)管凍精，各15支，精子密度≥108精子/mL，精子活率≥0.35。

1.1.2 主要試劑 PercollTM純化劑（GE Healthcare），PBS緩沖液（Solarbio），TRIzol?Reagent裂解液（Ambion），β-巰基乙醇（南京建成生物工程研究所），核酸助沉劑（Acryl Carrier），DNase/Rnase -Free Water，RNeasy Kit（ 德 國(guó)，Qiagen），Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit（Roche），槍頭和試管均用DEPC處理。

1.2 方法

1.2.1 精液解凍及精子純化 從液氮中取出細(xì)管凍精，38℃水浴解凍，分別檢測(cè)每頭牦牛精液密度，從每頭牦牛精液中取相同數(shù)量的精子構(gòu)建精子池，從精子池中取約3×107個(gè)精子細(xì)胞進(jìn)行純化。將精液緩慢在3倍體積45% Percoll單層梯度液上層，1 500 r/min離心20 min，棄上清；向沉淀中加3 mL 1×PBS緩沖液，渦旋30 s，5 000 r/min離心5 min，留沉淀，清洗2次。

1.2.2 精子總RNA提取 純化后的精子沉淀用RNeasy Kit（德國(guó)，Qiagen）、熱TRIzol法和TRIzol一步法分別提取總RNA，每種提取方法按精子數(shù)量加入適量裂解液，即每1×107個(gè)精子細(xì)胞加1 mL TRIzol或600 μL提取RLT緩沖液。熱TRIzol法提取的主要步驟：向洗滌后的精子沉淀中加適量TRIzol，反復(fù)吹打5 min，渦旋30 s；加 40 μLβ-巰基乙醇，混勻，65℃ 水浴 45 min，立即取出冰浴1 min；加200 μL氯仿，用力振蕩15 s，室溫靜置10 min，12 000×g，4℃離心15 min；取水相，加500 μL異丙醇和5 μL核酸助沉劑，混勻，4℃靜置15 min，12 000×g，4℃離心10 min，棄上清；分別加75%乙醇和無(wú)水乙醇500 μL漂洗沉淀一次，5 000×g，4℃離心5 min，棄上清，室溫干燥，待乙醇完全揮發(fā)后，加 20 μL RNase-free Water水溶解 RNA。

TRIzol一步法提取的主要步驟：向精子沉淀中加入1 mL TRIzol，反復(fù)吹打5 min，渦旋30 s，室溫靜置10 min后，直接加200 μL氯仿，其余步驟與熱TRIzol法相似。

RNeasy Kit提取的主要步驟：向沉淀中加適量RLT緩沖液，吹打30 s，反復(fù)通過(guò)20 G一次性注射器針頭10次以剪切DNA；加入等體積70%乙醇，吹打混勻后加至RNA吸附柱，8 000 ×g離心15 s；棄液后向吸附柱中加350 μL RW1緩沖液，8 000×g離心15 s；加100 μL Dnasel工作液至吸附柱，室溫靜置15 min，加 350 μL RW1緩沖液，再漂洗 1次；加 500 μL RPE緩沖液至吸附柱，8 000×g離心15 s；加500 μL RPE緩沖液至吸附柱，12 000×g離心2 min；加20 μL RNasefree Water 水至吸附柱膜上，12 000×g離心1 min，收集管中的洗脫液即為精子總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定含量和OD260/280。

1.2.3 反 轉(zhuǎn) 錄 取 10 μL 總 RNA， 加 1 μL Oligo（dT）

18，2 μL隨機(jī)引物，混勻，65℃孵育10 min后迅速置于冰上；加5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（含Mg2+）4 μL， RNA酶抑制劑0.5 μL，dNTPs（10 mmol/ L）2 μL 和逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，混勻后，25℃ 10 min，55℃ 30 min，85℃ 5 min，冰上急冷5 min終止反應(yīng)，-20℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA作模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。

1.2.4 RNA完整性及基因組DNA和體細(xì)胞去除效果檢測(cè) 利用Primer5.0軟件根據(jù)GenBank中牛mRNA和cDNA設(shè)計(jì)引物（表1）。CDH1（NCBI登錄號(hào)：NM_001002763.1）、CD45（NCBI登錄號(hào)：NM_0012 06523.1）、和c-kit（NCBI登錄號(hào)：NM_001166484.1）基因分別作為表皮細(xì)胞、白細(xì)胞和生殖細(xì)胞污染的標(biāo)記基因。GAPDH（NCBI登錄號(hào)：NM_001034034.2）、β-actin（NCBI登 錄 號(hào)：NM_173979.3）、SRY（NCBI登錄號(hào)：NM_001014385.1）和RPS23（NCBI登錄號(hào)：NM_001034690.2）基因用于檢測(cè)RNA完整性。其中GAPDH基因的第3外顯子和第4外顯子設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，其產(chǎn)物涵蓋了第4內(nèi)含子完整序列，當(dāng)RNA不含DNA污染時(shí)，RT-PCR產(chǎn)物條帶為126 bp，若含DNA污染時(shí)，則顯示217 bp條帶。25 μL PCR體系：TaqTMDNA 聚合酶 mix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 6 μL，RNase-free water 4.5 μL。PCR 程 序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s（表1），循環(huán)36次；最后72℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物取5 μL經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS19.0對(duì)總RNA量及濃度、OD260/280值和單個(gè)精子細(xì)胞RNA量進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 冷凍精子的純化 為了盡可能獲得較多精子，同時(shí)又盡量去除精液中其他細(xì)胞的污染，本次實(shí)驗(yàn)采用3倍體積、單層45% Percoll梯度液離心純化精子。如圖1所示，純化效果較為理想，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 精子純化結(jié)果

2.2 精子總RNA純度檢測(cè) 由表2可知，試劑盒提取精子RNA的OD260/280值為1.89，顯著高于熱TRIzol法與TRIzol一步法（P＜0.05），證明RNA純度較高；熱TRIzol法與TRIzol一步法提取精子RNA的OD260/280值為1.64～1.66，均小于1.8，可能混有酚類(lèi)、醇類(lèi)、蛋白質(zhì)或胍鹽。采用試劑盒提取精子總RNA量為988.67 ng，每個(gè)精子細(xì)胞RNA平均含量為32.96 fg，均顯著高于熱TRIzol法與TRIzol一步法（P＜0.05）；采用熱TRIzol法提取精子總RNA量為753.33 ng，每個(gè)精子細(xì)胞RNA平均含量為25.11 fg，均顯著高于TRIzol一步法（P＜0.05）。表明試劑盒可獲得較高質(zhì)量的精子總RNA。

2.3 RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.3.1 RNA完整性及基因組DNA去除效果檢測(cè) 如圖2所示，各個(gè)RNA樣品均在126 bp和177 bp處出現(xiàn)條帶，與GAPDH和β-actin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物理論長(zhǎng)度一致。擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有出現(xiàn)217 bpGAPDH基因組條帶，說(shuō)明3種方法制備的精子總RNA完整性較好且均無(wú)基因組DNA污染。從條帶的亮度上分析，試劑盒提取的總RNA經(jīng)RT-PCR檢測(cè)的基因條帶最清晰，與總RNA濃度檢測(cè)結(jié)果一致。

圖2 GAPDH和β-actin基因擴(kuò)增電泳圖

各RNA樣品針對(duì)成熟精子細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因SRY、RPS23的RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖3），試劑盒提取的RNA擴(kuò)增出SRY、RPS23基因條帶；熱TRIzol和TRIzol一步法均只出現(xiàn)SRY基因條帶，這說(shuō)明試劑盒提取精子總RNA的質(zhì)量?jī)?yōu)于另外2種方法。

圖3 SRY 和 RPS23基因擴(kuò)增電泳圖

2.3.2 體細(xì)胞去除效果檢測(cè) 各總RNA樣品針對(duì)基因CD45、CDH1和c-kit的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4），3種不同方法制備的精子總RNA樣品均未檢測(cè)到上述目的基因條帶，表明各RNA樣品中均未受到表皮細(xì)胞、白細(xì)胞和生殖細(xì)胞污染。

圖4 CD45、CDH1和c-kit基因擴(kuò)增電泳圖

表2 總RNA濃度檢測(cè)

3 討 論

目前，通過(guò)哺乳動(dòng)物精液分析基因表達(dá)評(píng)估動(dòng)物的生殖能力被廣泛認(rèn)為是一種新的技術(shù)手段[8]。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括精原干細(xì)胞的分裂、分化到成熟精子的形成。精子mRNA表達(dá)水平反映睪丸精子發(fā)生的過(guò)程，一些重要的調(diào)節(jié)因子通過(guò)影響靶mRNA的表達(dá)進(jìn)而參與精子發(fā)生的各個(gè)階段，可用于雄性不育的檢測(cè)和治療[9]。精子純化是RNA制備的關(guān)鍵，而精液中存在精漿及生精細(xì)胞、白細(xì)胞和上皮細(xì)胞[10]等的污染，提取RNA首要去除基因組DNA的污染。目前，Percoll密度梯度離心法和上浮法純化精子被廣泛應(yīng)用于生殖技術(shù)中。有研究表明，Percoll梯度離心法相比于上浮法可更有效地去除精液中存在的其他細(xì)胞成分，活精子回收率更高[12]。周其趙等[13]通過(guò)比較雙層及單層梯度液純化效果發(fā)現(xiàn)，2種方法均能分離出精子，但單層梯度液分離后回收率較高，符合精子RNA提取要求。本實(shí)驗(yàn)采用3倍體積45% Percoll單層梯度液進(jìn)行純化，顯微鏡下未見(jiàn)到圓形細(xì)胞，與人精子上研究結(jié)果一致[14]；RT-PCR結(jié)果顯示，CDH1、CD45和c-kit標(biāo)記基因條帶出現(xiàn)，說(shuō)明提取的RNA無(wú)體細(xì)胞污染[15]。

另外，精子染色質(zhì)重塑產(chǎn)生濃縮的核結(jié)構(gòu)導(dǎo)致核基因組轉(zhuǎn)錄受到抑制，且這種包裝存在物種差異，因此各物種提取精子RNA的最適方法不同。近年來(lái)，人、奶牛常采用試劑盒提取精子RNA[5,11]，豬精子RNA采用TRIzol法提取[7]，Gilbert等[6]采用熱TRIzol法對(duì)牛精子RNA提取進(jìn)行了優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)中，TRIzol一步法與熱TRIzol法提取牦牛精子RNA，OD260/280值在1.6左右。OD260/280值偏低的原因可能與精子RNA含量太少、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性和精子使用量大有關(guān)；精子核、膜和尾的結(jié)構(gòu)都與普通細(xì)胞有差異，特別是核結(jié)構(gòu)緊密，較難裂解；精子核酸、蛋白質(zhì)含量高，加之使用精子數(shù)量大（約為1×107個(gè)），所以提取的RNA可能存在蛋白質(zhì)污染。而試劑盒（OD260/280=1.89）提取精子不論從純度還是濃度上均優(yōu)于上述2種方法，推測(cè)是由于試劑盒能快速充分裂解精子細(xì)胞核，同時(shí)吸附柱對(duì)精子RNA較敏感，可實(shí)現(xiàn)少量RNA的富集。

精子RNA完整性以及是否存在基因組DNA的污染通常用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，GAPDH只擴(kuò)增出126 bp條帶，無(wú)217 bp條帶，從而排除了基因組DNA的污染。通過(guò)擴(kuò)增β-actin、SRY和RPS23基因以確定RNA完整性[16]。RT-PCR結(jié)果顯示，試劑盒能夠擴(kuò)增出完整的β-actin、SRY和RPS23條帶，而另外2種方法均不能擴(kuò)增出RPS23基因條帶，可見(jiàn)試劑盒提取的牦牛精子RNA完整性更好，這與奶牛上的研究一致[11]?？赡苁怯捎谠噭┖蟹ㄌ崛〉腞NA操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，減少了RNA的降解。但與于艷等[14]在人精子上研究不同，可能是精子種屬差異較大所致。

4 結(jié) 論

本研究采用試劑盒（RNeasy Kit）提取牦牛精子RNA效果優(yōu)于熱TRIzol法和TRIzol一步法，它能使牦牛精子更充分的裂解，且操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，可實(shí)現(xiàn)少量RNA的制備以及低豐度基因在精子特異性表達(dá)的分析，為后續(xù)牦牛精子的分子生物學(xué)研究提供參考。

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