李崇陽，趙亞涵，郝海生，杜衛(wèi)華，劉 巖，龐云渭，朱化彬，趙學(xué)明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，北京100193）

性控凍精可用于動(dòng)物群體擴(kuò)繁以縮短遺傳育種進(jìn)程、提高畜牧生產(chǎn)效益[1]等。商業(yè)化的奶牛性控凍精用于人工授精，青年牛受胎率約為40%，遠(yuǎn)低于常規(guī)凍精（70%左右）[2]。另外，奶牛性控凍精體外受精能力顯著低于常規(guī)精液，部分卵裂率僅為30%左右，囊胚率在10%左右[3]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，性控凍精受精能力低與其制備過程產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）緊密相關(guān)[4-6]。精子經(jīng)歷一系列分選過程，包括稀釋、激光、分離加壓及后續(xù)冷凍解凍，刺激精子產(chǎn)生大量ROS[6]。過量的ROS引起精子內(nèi)抗氧化體系失衡，造成精子膜脂質(zhì)過氧化、DNA片段化等結(jié)構(gòu)氧化損傷，影響受精能力[7]。流式分選會(huì)除去富含抗氧化酶的精漿，導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化酶不足，因此補(bǔ)充外源性抗氧化劑可有效去除過量的ROS[8]。研究證實(shí)，白藜蘆醇是一種天然多酚抗氧化物質(zhì)，可通過酚羥基給電子反應(yīng)清除ROS[9]，并抑制線粒體呼吸鏈中復(fù)合酶III活動(dòng)，干擾ROS產(chǎn)生[10]。但白藜蘆醇在性控凍精中抗氧化應(yīng)用研究卻非常少。本研究通過在奶牛性控凍精的洗精液和受精液中添加不同濃度的白藜蘆醇，經(jīng)獲能孵育，分析白藜蘆醇對(duì)精子ROS含量、丙二醛（MDA）含量、頂體完整性及體外受精能力的影響，從而篩選出白藜蘆醇的有效濃度，為提高性控凍精質(zhì)量和體外受精能力提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑和儀器 除特殊說明，所有實(shí)驗(yàn)試劑均購(gòu)于Sigma 公司（美國(guó)）。分光光度計(jì)（島津，日本），激光共聚焦顯微鏡（Leika SP8，德國(guó)），熒光倒置顯微鏡（Nikon，日本）。

1.1.2 性控凍精的制備 委托山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)荷斯坦奶牛精液進(jìn)行X、Y精子分離，得到性控凍精用于本實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 卵母細(xì)胞的獲取 從河北屠宰場(chǎng)收集新鮮的牛卵巢，經(jīng)過清洗放入含溫生理鹽水的保溫杯中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，通過真空蠕動(dòng)泵抽出2～8 mm卵泡中卵母細(xì)胞，無菌環(huán)境下?lián)斐鰞?yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞，放入成熟液中培養(yǎng)。1.2 精子樣品制備 將性控凍精從液氮中取出，投入溫水中解凍，根據(jù)白藜蘆醇濃度（0、10-3、10-4、10-5mol/L），將精子分成4個(gè)不同組別，分別轉(zhuǎn)入含不同濃度白藜蘆醇的洗精液的15 mL離心管中，1 500 r/min離心洗滌5 min，洗2次，棄掉上清，再分別加入含對(duì)應(yīng)濃度白藜蘆醇的受精液重懸，調(diào)整精子密度106個(gè)/mL，放入恒溫培養(yǎng)箱孵育1.5 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 精子ROS水平 各組分別取100 μL重懸精液，加入1 μL DCFH-DA（工作液濃度10 μmol/L），恒溫箱避光孵育20 min，1 500 r/min離心洗滌5 min，洗滌2次洗去多余的染料，加入100 μL PBS重懸沉淀，每次吸取5 μL的重懸精液滴于載玻片上，壓片后置于倒置熒光顯微鏡下照相。ROS水平采用圖像分析軟件Image J進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析，并至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 精子MDA含量 各組分別取100 μL重懸精液，按照MDA檢測(cè)試劑盒（南京建成）提供的試劑盒說明書，混勻加入各組反應(yīng)試劑，沸水浴反應(yīng)90 min，隨后取出流水冷卻，4 000 r/min離心洗滌10 min，取上清利用分光光度計(jì)在532 nm處，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零后，通過測(cè)定各管吸光度值計(jì)算MDA含量，并至少生物學(xué)重復(fù)3次。

1.3.3 精子頂體完整性 各組分別取100 μL重懸精液，加入2.5 μL FITC-PN（2 mg/mL），恒溫箱避光孵育10 min，隨后加入2.5 μL PI (1 mg/mL)恒溫箱避光孵育5 min，隨后1 500 r/min離心5 min，洗去多余染料，沉淀加100 μL PBS重懸，吸取5 μL重懸精液于載玻片上，壓片后置于導(dǎo)致熒光顯微鏡下檢測(cè)精子頂體完整性，并至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 精子體外受精能力 分別取各組重懸精液90 μL加入到含10 μL受精液的受精滴中，形成100 μL每孔的受精滴。將體外成熟培養(yǎng)22～24 h的卵母細(xì)胞吸出，用透明質(zhì)酸酶消化吹打脫去部分卵丘細(xì)胞，終止液終止消化，挑選出剩余2～3層卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，在受精液中洗滌2遍，移入受精滴中，每個(gè)受精滴中放25枚卵母細(xì)胞，精卵共孵育16～18 h，脫去卵丘細(xì)胞，移入mCRlaa胚胎培養(yǎng)前期液中培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)卵裂率，并將卵裂后的受精卵放入胚胎培養(yǎng)后期液中，隔天半量換液，第7天統(tǒng)計(jì)囊胚率，并至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)組至少進(jìn)行3次以上的生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS 9.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA顯著性分析，P＜0.05被認(rèn)為是差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精ROS含量的影響如表1所示，10-3、10-4、10-5mol/L白藜蘆醇的處理組ROS含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著白藜蘆醇濃度的降低，對(duì)ROS去除效果降低，10-3mol/L處理組與10-4mol/L處理組去除效果相近（P＞0.05）。

表1 不同濃度的白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精ROS含量影響

2.2 不同濃度白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精MDA含量的影響 如表2所示， 10-3、10-4、10-5mol/L白藜蘆醇處理組的MDA含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。10-4mol/L白藜蘆醇處理組MDA含量最低，顯著低于其他3組（P＜0.05）。

表2 不同濃度的白藜蘆醇添加對(duì)性控凍精MDA的影響

2.3 不同濃度白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精頂體完整性的影響 如表3所示，各組間頂體完整的死精子率以及頂體損傷的死精子率差異均不顯著（P＞0.05）。10-3、10-4、10-5mol/L白藜蘆醇處理組的頂體完整活精子比例顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 不同濃度白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精體外受精影響由表4可以看出， 10-4mol/L 白藜蘆醇處理組相較于0、10-3、10-5mol/L 白藜蘆醇處理組可顯著提高性控凍精的卵裂率和囊胚率（P＜0.05）。

3 討 論

在生殖生物學(xué)領(lǐng)域，哺乳動(dòng)物受精機(jī)理研究越來越深入，精子質(zhì)量往往決定著受精能力的高低，因此，準(zhǔn)確判斷和評(píng)估精子質(zhì)量以及闡明精子質(zhì)量的影響因素成為生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物的精子受精過程涉及一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，如精子獲能、超活化、頂體反應(yīng)和精卵結(jié)合等，精子功能相關(guān)蛋白在這些過程中往往發(fā)揮著重要作用，從而影響精子的受精能力[11-12]。近年來，大量研究證實(shí)，精子受精過程中生理濃度的ROS可通過對(duì)精子相關(guān)功能蛋白進(jìn)行修飾[13]，并通過氧化膽固醇促進(jìn)精子獲能，增強(qiáng)精子膜流動(dòng)性繼而提高精子受精能力[14]。然而過量的ROS會(huì)造成精子氧化損傷，性控凍精分選過程會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，同時(shí)后續(xù)的冷凍解凍及離心等過程都會(huì)產(chǎn)生大量ROS，這些過量的ROS不僅僅損害精子膜結(jié)構(gòu)、頂體膜完整性，并且還影響精子獲能等過程，導(dǎo)致受精能力低下[6,15]。

表3 不同濃度的白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精頂體完整性的影響

表4 不同濃度的白藜蘆醇處理對(duì)性控凍精體外受精的影響

目前，許多常規(guī)精液抗氧化研究證實(shí)，通過添加外源性抗氧化劑可以有效去除多余的ROS，保護(hù)精子結(jié)構(gòu)與功能，提高精子受精能力[9-10]。María等[9]和Berrougui等[10]報(bào)道，白藜蘆醇具有高效的抗氧化功能，不僅可以直接清除ROS同時(shí)可抑制ROS的產(chǎn)生，并可通過調(diào)節(jié)精子內(nèi)源性谷胱甘肽等抗氧化酶的活性發(fā)揮抗氧化作用。本研究表明，相較于對(duì)照組，10-3、10-4、10-5mol/L白藜蘆醇處理均可有效降低ROS含量，并隨著濃度的降低，ROS清除能力逐漸下降，其中10-3mol/L白藜蘆醇處理對(duì)ROS的清除能力略高于10-4mol/L白藜蘆醇組，但清除能力相近。這主要是由于白藜蘆醇是一種高效抗氧化劑，在較低濃度時(shí)仍具有較高的抗氧化功能，高濃度的抗氧化劑固然可清除更多的ROS，但清除過多的ROS可能不利于受精過程。

Longobardi等[16]報(bào)道，精子質(zhì)膜富含不飽和脂肪酸，極易受到氧化損傷，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（LPO），該反應(yīng)是一個(gè)級(jí)聯(lián)化反應(yīng)，其終產(chǎn)物如MDA等會(huì)繼續(xù)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，因此通過MDA的檢測(cè)可以評(píng)估LPO反應(yīng)及氧化損傷程度。本研究結(jié)果表明，添加10-4mol/L白藜蘆醇可有效降低MDA含量，這主要是由于白藜蘆醇處理可以有效降低ROS水平，進(jìn)而抑制LPO反應(yīng)，降低LPO終產(chǎn)物MDA的含量。

頂體是精子特有的結(jié)構(gòu)之一，受精過程中頂體反應(yīng)的發(fā)生是受精成功的前提條件，然而過量的ROS可造成精子胞內(nèi)鈣離子增加，提前誘發(fā)頂體反應(yīng)，造成這些頂體損傷的精子雖然活力等參數(shù)正常，但無法完成受精，因此檢測(cè)精子頂體完整性是評(píng)判精子受精能力的重要指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果表明，不同濃度白藜蘆醇的處理對(duì)頂體損傷的死精子或頂體完整的死精子比例都沒有顯著影響，但能顯著提高頂體完整的活精子比例，并降低頂體損傷活精子比例，這與Silva等[18]在羊上的結(jié)果相一致。造成這些結(jié)果的原因主要是白藜蘆醇具有高效抗氧化能力，清除過量ROS，從而抑制了頂體損傷。

另外，Longobardi等[16]報(bào)道，5×10-4mol/L白藜蘆醇通過提高水牛精子膜穩(wěn)定性，降低獲能相關(guān)變化和ROS含量從而可以提高精子受精能力。本研究發(fā)現(xiàn)，10-4mol/L白藜蘆醇處理可顯著提高性控凍精受精后的卵裂率和囊胚率，即可顯著提高性控凍精受精能力，與前人的研究符合。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇是一種高效抗氧化物質(zhì)，在解凍后的性控凍精中添加10-4mol/L的白藜蘆醇可以有效降低ROS含量，從而有效抑制精子膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低MDA等副產(chǎn)物對(duì)精子的毒害作用，并且有效抑制精子過早發(fā)生頂體反應(yīng)，進(jìn)而提高性控凍精的質(zhì)量和受精能力。

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