徐蛟天， 邊立功， 張 琰， 王 威， 陳孝祥， 陳鑫月， 李 慶， 鄧興力

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的膠質(zhì)細(xì)胞之一，其數(shù)量約占總膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的10%～20%，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，具有吞噬細(xì)菌、抗原呈遞、產(chǎn)生細(xì)胞因子和補(bǔ)體的能力[1]，呈現(xiàn)與外周巨噬細(xì)胞最相似的結(jié)構(gòu)和功能[2,3]。近年大量研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病中，如阿爾茨海默癥、帕金森病等，起著非常重要的作用[4,5]。

通過以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)研究神經(jīng)退行性疾病，已成為病理機(jī)制研究潛在的突破方向[6]。目前，用于小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的方法有震搖分離法[7]、營(yíng)養(yǎng)剝奪法[8]、溫和胰酶消化法[9]及用馬血清進(jìn)行培養(yǎng)得到富含小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法[10]。原有的分離純化方法產(chǎn)量低、周期長(zhǎng),難以滿足實(shí)驗(yàn)需要。因此，如何獲取高產(chǎn)量、高純度的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，已成為以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)的研究成敗的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。為此本研究擬通過改良傳統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與純化方法，進(jìn)一步優(yōu)化小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方案，以獲取高產(chǎn)量以及純度的小膠質(zhì)細(xì)胞。

1 材 料

1.1 動(dòng)物及主要設(shè)備 健康SPF級(jí)新生Spraque-Dawley(SD)大鼠，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標(biāo)儀(Bio-Tek)、正置、倒置熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 細(xì)胞培養(yǎng)耗材(Corning)、LPS(sigma)、DMEM/High glucose(HyClone)、Alex-Fluor 594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(Proteintech)、488-conjugated Donkey Anti-Mouse IgG(Proteintech)、青-鏈雙抗(PS,Invitrogen)、CD11b/c polyclonal Antibody(Proteintech，Source：Mouse)、Iba1 polyclonal Antibody(Proteintech，Source：Rabbit)、 FBS(BI)、L-Glutamine(Gibco)。DAPI(Beyotime)、抗熒光淬滅封片劑(Beyotime)、D-Hanks液(HyClone)、0.25%胰酶(Solarbio)。

2 方 法

2.1 取材和培養(yǎng) 取新生(24～48 h)SD大鼠5只，冰凍麻醉后，75%酒精浸泡消毒，剪取頭顱，置于冷D-Hanks液清洗并剪除顱骨取出腦組織，解剖顯微鏡下去除小腦、嗅球及腦干，分離海馬及中腦并盡量剝除腦膜，細(xì)刷輕微掃除殘余腦膜及出血點(diǎn)，僅留取大腦皮質(zhì)。收集大腦皮質(zhì)，D-Hanks液清洗后移至盛有3 ml D-Hanks液的培養(yǎng)皿，剪碎至≤1 mm3，平均移至3個(gè)15 ml規(guī)格離心管，等體積加入0.125%胰蛋白酶消化，37 ℃培養(yǎng)箱消化10 min(中間可吹打助消化)，待消化液粘稠狀消失，呈均勻乳白色，每個(gè)離心管等體積加入含10% FBS的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，200目濾網(wǎng)過濾，去除未消化完全的組織，1000 r/min，離心5 min，棄上清，小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整密度，以5×106密度接種于T25 cm2Flask，4 ml/瓶。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待大部分懸浮細(xì)胞貼壁后(一般4～8 h)，全量換液，更換含20% FBS小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞代謝情況2～3 d半量換液(第一次換液至第2次換液之間可間隔至5 d)。待細(xì)胞鋪滿瓶后可更換含10% FBS小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至7～10 d可收獲純化。小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基(DMEM/High glucose，10% FBS，1% PS，1% L-Glutamine，配制后4 ℃保存2 w)。

2.2 不同方法純化并計(jì)算小膠質(zhì)細(xì)胞純度及產(chǎn)量

2.2.1 手拍法純化小膠質(zhì)細(xì)胞純化 混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)7～10 d，倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞呈分層生長(zhǎng)，小膠質(zhì)細(xì)胞呈較強(qiáng)折光性，半貼壁或者懸浮生長(zhǎng)，純化前1 d，半量換液。手拍前，先輕柔吸除2 ml培養(yǎng)基，手拍法輕柔拍下上層小膠質(zhì)細(xì)胞，見培養(yǎng)基出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞時(shí)，收集細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以8×105個(gè)/ml密度接種多聚賴氨酸包被的24孔板爬片，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，去除多余培養(yǎng)基，1～2 d后鑒定。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞需要量，更換含(10%～20%)FBS培養(yǎng)基，3～4 d可再次收集純化。

2.2.2 分別用溫和胰酶法、搖床法純化小膠質(zhì)細(xì)胞，具體操作參考文獻(xiàn)[3,7,9]。

2.3 細(xì)胞免疫熒光染色 分別取純化后細(xì)胞，PBS清洗2次×1 min，含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)固定20 min，PBS清洗2次×5 min，0.1%的PBST(Triton X100+PBS)透膜15 min，10%的山羊血清封閉2 h，加一抗CD11b/c(1∶300)，Iba1(1∶300)，4 ℃孵育過夜，棄一抗，PBS清洗3次×5 min。避光操作，二抗Alex-Fluor594(1∶100)，Alex-Fluor488(1∶100)室溫孵，1.5 h，DAPI(2.5 μg/ml)孵育5 min，撈取爬片，封片劑封片，晾干后正置顯微鏡下拍照。

3 結(jié) 果

3.1 小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng) 小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)第3天可從形態(tài)上辨認(rèn)出小膠質(zhì)細(xì)胞，部分小膠質(zhì)細(xì)胞伸出突觸(見圖1A箭頭所指)，但大部分小膠質(zhì)細(xì)胞處于增殖期，形態(tài)上表現(xiàn)為圓形(見圖1A)。細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，細(xì)胞呈分層生長(zhǎng)，下面以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主伴有其他類型的膠質(zhì)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞，上層胞體較小，折光性較強(qiáng)，呈半懸浮或者懸浮生長(zhǎng)，圓形或者少數(shù)有突觸伸出的為小膠質(zhì)細(xì)胞(見圖1B箭頭所指)，細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞密度明顯增加，可見小膠質(zhì)細(xì)胞成簇聚集生長(zhǎng)，表現(xiàn)出密度依賴性(見圖1C)。細(xì)胞培養(yǎng)至第9～11天，細(xì)胞完全鋪滿瓶底可收集純化。

3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞純化 取混合培養(yǎng)第10天細(xì)胞，純化接種1 d后，大部分細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，形態(tài)表現(xiàn)為梭形、桿狀等不規(guī)則形態(tài)，部分細(xì)胞可見1～2個(gè)較長(zhǎng)突起(見圖1D)。

3.3 小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 細(xì)胞免疫熒光，小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體CD11b/c、Iba1雙染鑒定為陽性，小膠質(zhì)細(xì)胞陽性率>96%。綠色熒光為CD11b/c陽性細(xì)胞(見圖2A)；紅色熒光為Iba1陽性細(xì)胞(見圖2B)；黃色熒光為CD11b/c、Iba1雙陽性細(xì)胞(見圖2C)；藍(lán)色熒光為DAPI陽性細(xì)胞核(見圖2A～C)。

3.4 不同純化方法小膠質(zhì)細(xì)胞純度及產(chǎn)量計(jì)數(shù)

3.4.1 不同純化方法小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)第10天，分別用手拍法、溫和胰酶消化法以及搖床法分別純化小膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光染色鑒定，3種純化方法均可純化產(chǎn)生CD11b/c陽性細(xì)胞(見圖3A～C)。

3.4.2 不同方法純化小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：(1)手拍法與溫和胰酶法純化小膠質(zhì)細(xì)胞其細(xì)胞產(chǎn)量明顯高于搖床法(見圖4A)；(2)手拍法純化小膠質(zhì)細(xì)胞純度明顯高于溫和胰酶法,而與搖床法無顯著差異(見圖4B)。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)。A：細(xì)胞培養(yǎng)第3天；B：細(xì)胞培養(yǎng)第5天；C：細(xì)胞培養(yǎng)第7天；D：細(xì)胞純化后1 d。bar=20 μm

圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定。A：CD11b/c陽性細(xì)胞；B：Iba1陽性細(xì)胞；C：CD11b/c、Iba1雙陽性細(xì)胞。bar=50 μm

圖3 不同方法純化小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定。A：手拍法；B：溫和胰酶法；C：搖床法。bar=50 μm

圖4 不同方法純化小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)。A：細(xì)胞產(chǎn)量；B：細(xì)胞純度*P<0.05

4 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中內(nèi)特有的具有免疫功能的細(xì)胞[11]，從形態(tài)及生理學(xué)功能上將小膠質(zhì)細(xì)胞歸類為CNS的巨噬細(xì)胞，是腦從數(shù)量上小膠質(zhì)細(xì)胞占中樞神經(jīng)系統(tǒng)中整個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的5%～20%[12]。有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞是最早對(duì)CNS損傷做出反應(yīng)的細(xì)胞，靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌促進(jìn)神經(jīng)元的成熟發(fā)育[11]，而過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞則引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)損傷神經(jīng)元[13]?，F(xiàn)代臨床研究證明神經(jīng)性炎癥，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)長(zhǎng)期存在的慢性炎癥對(duì)帕金森為代表的一類神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要影響作用[2]。而此過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化以及引起的一系列免疫反應(yīng)在此類疾病病程進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用[14]。

因此，以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)，通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，已成為帕金森病等神經(jīng)退行性疾病機(jī)制研究潛在的突破方向。而如何建立一種高效的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法來獲取高產(chǎn)量、高純度以及活性穩(wěn)定的小膠質(zhì)細(xì)胞，已成為此項(xiàng)研究成敗的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞的方法多是參考McCarthy等方法，選取出生1～4 d內(nèi)的新生鼠培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，國(guó)內(nèi)也有部分學(xué)者選用出生前胎鼠[15]。而我們認(rèn)為用出生24 h新生鼠培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞效果最佳，此時(shí)的鼠大腦的腦膜及血管最易剝離，且腦皮質(zhì)區(qū)出血點(diǎn)最少。通過大量實(shí)踐我們?cè)趥鹘y(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上做如下改進(jìn)：(1)取材，去除腦干、中腦以及嗅球，只留取皮質(zhì)部分；(2)消化過程中可通過增加胰酶用量減低胰酶濃度，與分多管消化相結(jié)合的方式縮短組織消化時(shí)間；(3)適當(dāng)增加小膠質(zhì)細(xì)胞的接種密度(1×106個(gè)/ml)；(4)采用手拍法與加差速貼壁相結(jié)合的方式純化小膠質(zhì)細(xì)胞。在小膠質(zhì)細(xì)胞整個(gè)培養(yǎng)過程中，我們認(rèn)為腦組織的消化程度和第一次更換培養(yǎng)基時(shí)間點(diǎn)的把握是決定小膠質(zhì)細(xì)胞純度和產(chǎn)量的關(guān)鍵。一方面，腦組織消化時(shí)間不夠，大量未消化完全的組織塊被過濾而降低了混合懸浮細(xì)胞的產(chǎn)量；另一方面，胰酶的過度消化則影響小膠質(zhì)細(xì)胞的貼壁能力不利于細(xì)胞的貼壁。我們的實(shí)踐認(rèn)為，把胰酶消化時(shí)間控制在10 min之內(nèi)，第一次更換培養(yǎng)基時(shí)間在接種后3～4 h，培養(yǎng)可獲取較高的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量及純度?；旌夏z質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)第3天就可在形態(tài)上辨認(rèn)出小膠質(zhì)細(xì)胞(見圖1A，箭頭所指)，細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，可見折光性較強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，形態(tài)多為圓形(見圖1B，箭頭所指)；細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，可見折光性較強(qiáng)的小膠質(zhì)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，細(xì)胞呈半貼壁生長(zhǎng)，部分細(xì)胞處懸浮狀態(tài)，部分貼壁生長(zhǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形、分枝狀等形態(tài)(見圖1C，箭頭所指)。細(xì)胞培養(yǎng)10～14 d，可見混合細(xì)胞鋪滿平底，且有大量折光性較強(qiáng)的細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，此時(shí)可用于分離純化，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。在改良培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，通過不同的純化方法獲取小膠質(zhì)細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)相同的培養(yǎng)條件下，手拍法與溫和胰酶消化法均可獲取較高的細(xì)胞產(chǎn)量，但前者獲取的細(xì)胞純度更高。而搖床法的細(xì)胞產(chǎn)量相比較前兩者產(chǎn)量均較低(見圖4)。實(shí)踐表明，用手拍法與差速貼壁法相結(jié)合的方式，省去離心這一步操作可減少離心對(duì)細(xì)胞的損傷，同時(shí)可避免離心過程造成細(xì)胞數(shù)量上的損失。細(xì)胞在純化后8～10 h可見細(xì)胞伸出突觸，呈長(zhǎng)梭形、分枝狀等典型形態(tài)(見圖1D)。小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體CD11b/c、Iba1雙染鑒定為陽性，小膠質(zhì)細(xì)胞陽性率>95%(見圖3A～C)。

因此我們認(rèn)為，在改良傳統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，再通過優(yōu)化純化方法，用手拍法與差速離心相結(jié)合的方式可獲取更高純度以及產(chǎn)量的小膠質(zhì)細(xì)胞。可有效滿足于基于小膠質(zhì)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的各種實(shí)驗(yàn)，特別是以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)，炎癥相關(guān)以及神經(jīng)保護(hù)方面與帕金森病相關(guān)的研究。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞在隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)以及傳代后，細(xì)胞的質(zhì)量出現(xiàn)明顯降低，這可能與純化后缺少其他膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)。如何在提高純度和產(chǎn)量的同時(shí)進(jìn)一步延長(zhǎng)純化后小膠質(zhì)細(xì)胞的生存時(shí)間還需進(jìn)一步的研究和探討。

[1]孔惠敏,甘 娜,尹 飛,等.體外小膠質(zhì)細(xì)胞活化及mrp8表達(dá)關(guān)系的研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2013,12(30):1060-1063.

[2]Crotti A,Ransohoff RM.Microglial physiology and pathophysiology:Insights from genome-wide transcriptional profiling[J].Immunity,2016,44(3):505-515.

[3]Banati RB.Neuropathological imaging:In vivo detection of glial activation as a measure of disease and adaptive change in the brain[J].Br Med Bull,2003,65:121-131.

[4]Ransohoff RM,El Khoury J.Microglia in health and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2015,8(1):a020560.

[5]Hong ZY,Shi XR,Zhu K,et al.Scm-198 inhibits microglial overactivation and attenuates abeta(1-40)-induced cognitive impairments in rats via jnk and nf-small ka,cyrillicb pathways[J].J Neuroinflammation,2014,11:147.

[6]Alam Q,Alam MZ,Mushtaq G,et al.Inflammatory process in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases:Central role of cytokines[J].Curr Pharm Des,2016,22(5):541-548.

[7]Giulian D,Baker TJ.Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain[J].J Neurosci,1986,6(8):2163-2178.

[8]Hao C,Richardson A,Fedoroff S.Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture:Characterization and properties of the macrophage-like cells[J].Int J Dev Neurosci,1991,9(1):1-14.

[9]Saura J,Tusell JM,Serratosa J.High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization[J].Glia,2003,44(3):183-189.

[10]Colton CA,Yao J,Taffs RE,et al.Abnormal production of interleukin-1 by microglia from trisomy 16 mice[J].Neurosci Lett,1991,132(2):270-274.

[11]Chen Z,Trapp BD.Microglia and neuroprotection[J].J Neurochem,2016,136(Suppl 1):10-17.

[12]Hwang IK,Park JH,Lee TK,et al.Cd74-immunoreactive activated m1 microglia are shown late in the gerbil hippocampal ca1 region following transient cerebral ischemia[J].Mol Med Rep,2017,15(6):4148-4154.

[13]徐蛟天,陳孝祥,鄧興力,等.Nurr-1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2017,33(2):160-166.

[14]Solano FR,Mahesula S,Apple DM,et al.Neurogenic niche microglia undergo positional remodeling and progressive activation contributing to age-associated reductions in neurogenesis[J].Stem Cells Dev,2016,25(7):542-555.

[15]張 敏,魏桂榮,梅元武,等.三種小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法比較[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2005,13(2):97-99.