呂園園， 齊曉嵐， 李 毅， 官志忠， 張 力

在神經(jīng)系統(tǒng)中，突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間發(fā)生功能聯(lián)系的主要部位[1]，也是信號傳導(dǎo)的樞紐。突觸作為神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)=基礎(chǔ)，在人的學(xué)習(xí)記憶、應(yīng)激、認(rèn)知能力方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的可塑性。突觸丟失意味著突觸可塑性的喪失以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中斷，致使學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能障礙[2]。阿爾茨海默病是一種神經(jīng)元退行性變疾病，表現(xiàn)為記憶障礙、認(rèn)知能力衰退、智力和理解能力減弱。盡管AD的主要病理學(xué)改變是Aβ沉積形成的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，但近年的研究結(jié)果表明突觸丟失是其認(rèn)知功能低下的主要危險因素之一，在認(rèn)知功能障礙早期就已經(jīng)出現(xiàn)，而且先于Aβ沉積形成的老年斑和神經(jīng)元丟失[3,4]，但引起AD腦中突觸丟失及功能低下的具體機(jī)制目前還不十分清楚。突觸相關(guān)蛋白對于維持突觸功能和形態(tài)具有重要作用。因此，研究突觸相關(guān)蛋白的改變對于闡明AD的發(fā)病機(jī)制及病情的轉(zhuǎn)歸顯得十分重要。目前許多突觸相關(guān)蛋白已經(jīng)得到驗證，具有標(biāo)志性的蛋白突觸素(synaptophysin,SYP)可作為評估突觸功能的特異性標(biāo)志物之一。

本課題組前期研究表明α3 nAChR具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。因此，本課題通過轉(zhuǎn)染α3 nAChR-pcDNA3.1來研究α3 nAChR表達(dá)的變化對SYP的影響，進(jìn)而探討AD發(fā)病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購于ATCC公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶液、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)購于HyClone公司；胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；BamHI、Hind III購于大連寶生物工程有限公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent、Firststart Universal SYBR Green Master (Rox)、Genopure Plasmid Midi Kit、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 均購于Roche公司；Trizol試劑、BCA蛋白定量分析試劑盒、蛋白Marker均購于Thermo公司(美國)；α3 nAChR、β-actin、SYP上下游引物由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成；鼠抗α3 nAChR單克隆抗體(sc-365479)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗(sc-2005)均購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；鼠抗Synaptophysin單克隆抗體(ab8049)購于美國Abcam公司；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(#M20010)購于上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司；WB其他相關(guān)試劑購于Amersham公司。普通試劑購于Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 α3 nAChR-pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照GenBank提供的基因序列，利用Ambion公司官網(wǎng)提供的軟件來設(shè)計α3 nAChR引物序列，序列如下：α3 nAChR上游引物： 5’-CCCAAGCTTATGGGCTCTGGCCCGCTCTC-3’；α3 nAChR下游引物：5’-CGCGGATCCTCATAGCCCAGGTTCTTGATCGGAT-3’。上述序列用Blast Search檢測確定與α3 nAChR基因以外的人類已知序列無同源性，此引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。其5’、3’末端含有兩個限制性酶切位點，分別是BamHI和Hind III。運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR獲取人α3 nAChR基因，其序列大小為1470 bp，電泳鑒定并回收。利用T4 DNA連接酶將其連接至載體pcDNA3.1上，構(gòu)建質(zhì)粒重組體α3 nAChR-pcDNA3.1，空載質(zhì)粒為pcDNA3.1。用大腸桿菌DH5α做轉(zhuǎn)化，羅氏的去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒(中提)提取重組質(zhì)粒，雙酶切過夜，根據(jù)電泳結(jié)果鑒定酶切片段大小，雙向測序鑒定堿基序列和方向。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染 用完全培養(yǎng)基(含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基)于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長良好時，消化并傳代于六孔板中，此時用含15%胎牛血清不含雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時,按照本課題組前期優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件(轉(zhuǎn)染試劑：質(zhì)粒為3∶1)進(jìn)行轉(zhuǎn)染[5]，設(shè)置對照組、空載質(zhì)粒組和實驗組。轉(zhuǎn)染6 h后更換不含雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞，測定α3 nAChR mRNA及蛋白的表達(dá)水平。實驗每次3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測α3 nAChR、SYP mRNA表達(dá)情況 采用Trizol一步法提取SH-SY5Y細(xì)胞總RNA，再以總RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行Real-time PCR，以cDNA為擴(kuò)增模板。運(yùn)用Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒，α3 nAChR、SYP、β-actin引物序列(見表1)，在ABI Prism 7300型實時熒光定量PCR儀上收集待測基因及內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增循環(huán)的熒光信號，用Applied Biosystems SDS2.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以β-actin 為內(nèi)參照分析結(jié)果，并計算α3 nAChR、SYP的mRNA相對表達(dá)水平(RQ=2-△△Ct)，并對其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗每次3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測α3 nAChR、SYP的蛋白表達(dá)水平 向六孔板中加入裂解液，用細(xì)胞刮收集并提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法定量蛋白。WB法檢測α3 nAChR、SYP蛋白的表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參照?；叶戎涤肐mage J軟件進(jìn)行分析，計算α3 nAChR、SYP蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度值的百分比作為蛋白表達(dá)水平。實驗每次3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若方差不齊時改用Dunnett’s T3校正檢驗。P<0.05表示實驗結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 待測基因的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2 結(jié) 果

2.1 α3 nAChR-pcDNA3.1質(zhì)粒構(gòu)建的鑒定 將α3 nAChR-pcDNA3.1重組質(zhì)粒用BamHI和Hind III 進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約1500 bp和5000 bp處出現(xiàn)兩個條帶(見圖1)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定得到的結(jié)果與實驗設(shè)計的模板核苷酸序列一致(見圖2)，說明α3 nAChR基因上調(diào)的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)染后α3 nAChR mRNA及蛋白的表達(dá)水平 用Real-time PCR和WB方法檢測SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α3 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒后α3 nAChR mRNA及蛋白的表達(dá)水平分別增加了422%(見圖3A)和106%(見圖3B)，與空載質(zhì)粒組及對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空載質(zhì)粒組pcDNA 3.1與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。表明已經(jīng)將α3 nAChR-pcDNA 3.1質(zhì)粒成功的轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，并且增加了α3 nAChR mRNA和蛋白的表達(dá)水平；而空載質(zhì)粒不影響α3 nAChR的表達(dá)水平。

2.3 轉(zhuǎn)染后SYP mRNA及蛋白的表達(dá)水平 用Real-time PCR和WB方法檢測對照組、空載質(zhì)粒組和上調(diào)組的結(jié)果顯示，SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR上調(diào)后SYP mRNA及蛋白的表達(dá)水平增加了115%(見圖4A)和43%(見圖4B)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而空載質(zhì)粒組與對照組相比SYP mRNA及蛋白的表達(dá)水平均無明顯差異

M：DNA Marker (DL 5000)；1、2、3、4泳道：α3 nAChR-pcDNA3.1重組質(zhì)粒酶切樣品

圖1 α3 nAChR-cDNA3.1重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 α3 nAChR 核苷酸序列測序峰圖

與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義**P<0.05

圖3 SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染后α3 nAChR mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)水平

與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義**P<0.05

圖4 SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SYP mRNA(A)及蛋白(B)的表達(dá)水平

3 討 論

AD是一種與年齡和遺傳等許多因素相關(guān)的疾病，并以每20 y翻一倍的速度在增加，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[6]。因此對AD的研究以及尋找藥物治療靶點已經(jīng)成為研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能系統(tǒng)功能降低在AD早期階段已有表現(xiàn)，在AD的發(fā)生發(fā)展中有一定作用[7]。膽堿能系統(tǒng)中的神經(jīng)型尼古丁受體(Neuronal nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)在大腦的學(xué)習(xí)、認(rèn)知及記憶功能方面有一定的調(diào)節(jié)作用，并參與許多信號傳遞的調(diào)控。nAChR由α和β兩種亞基組成，不同種類的亞基以不同的形式組成不同的五聚體結(jié)構(gòu)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+、K+、Na+等離子的流動，其表達(dá)量的改變與Aβ呈負(fù)相關(guān)，在AD的發(fā)展中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，AD患者與正常同年齡對照組相比，α3亞基在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)分別減少了35%和29%；α4亞基在海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)中分別減少了35%和47%；α7亞基在海馬中減少了36%。由此可見，在AD患者腦組織中，膽堿能系統(tǒng)中的nAChR嚴(yán)重受損，通常會使學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重受損。因此，在AD的多種發(fā)病機(jī)制中nAChR數(shù)量的改變越來越引起學(xué)者的關(guān)注。而α3 nAChR是nAChR家族的主要成員之一，對乙酰膽堿和尼古丁具有重要的調(diào)節(jié)作用；α3 nAChR可對抗Aβ的毒性而起到神經(jīng)保護(hù)作用[10]，而在AD患者的腦組織中也檢測到α3 nAChR表達(dá)量降低[11]，這提示了α3 nAChR可能在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。

突觸可塑性是指突觸的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的特性，是學(xué)習(xí)記憶形成的基礎(chǔ)；伴隨人體機(jī)能逐漸降低及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展可見突觸的數(shù)量和面積顯著減少，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)結(jié)變的稀疏[12,13]。通過對AD患者的標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)了患者腦內(nèi)多種突觸相關(guān)蛋白表達(dá)含量降低，說明突觸的功能發(fā)生了改變[14]。SYP是一種與突觸功能和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的鈣結(jié)合膜蛋白，主要分布于神經(jīng)細(xì)胞軸突末端的突觸囊泡膜上，參與突觸重塑，常被作為突觸可塑性的特異性標(biāo)志物[1]。通過對SYP染色的定量和定位，可準(zhǔn)確的反映出突觸的密度和增生情況，從而推測突觸的數(shù)量和分布情況[15]。研究發(fā)現(xiàn)在AD患者大腦中檢測出SYP表達(dá)水平下降[16]，這可能與SYP參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、影響突觸可塑性有關(guān)[17]。SYP表達(dá)量的改變在AD的發(fā)病中可能起到十分重要的作用。

本實驗成功構(gòu)建了α3 nAChR-pcDNA 3.1重組質(zhì)粒體，通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法使SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR的表達(dá)量增加。實驗結(jié)果表明，當(dāng)α3 nAChR表達(dá)上調(diào)時可使SYP的表達(dá)量增加，可能是因為α3 nAChR表達(dá)量的增加反饋性調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成和釋放的增加，促使突觸囊泡增多，從而使突觸信息傳遞增強(qiáng)，延緩了AD的發(fā)生發(fā)展。因此，α3 nAChR在AD的發(fā)病機(jī)制中非常重要，但其明確的機(jī)制目前還不清楚，需進(jìn)一步的研究。

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