張?zhí)戽R 雷，玄 兵，孫世峰

（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.遼寧省沈陽(yáng)市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.遼寧省錦州市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 錦州 110016；4.遼寧省沈陽(yáng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

激素是一類(lèi)由動(dòng)物腺體產(chǎn)生或人工合成的可調(diào)，節(jié)生物機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和代謝的化學(xué)物質(zhì)。激素具有使動(dòng)物體肌肉擴(kuò)增、促進(jìn)生長(zhǎng)和育肥的作用，自20世紀(jì)50年代起被廣泛用作動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚是人工合成的非類(lèi)固醇同化性激素，曾被官方批準(zhǔn)用于畜牧業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中，用來(lái)提高飼料轉(zhuǎn)化率及促進(jìn)牲畜生長(zhǎng)。20世紀(jì)80年代左右，毒理學(xué)研究表明這些藥物會(huì)引發(fā)癌癥，為了防止這些激素隨畜產(chǎn)品進(jìn)入人體，各國(guó)陸續(xù)頒布法令禁止在畜牧業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中使用。2002年，農(nóng)業(yè)部公布《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》中，明確規(guī)定玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚為禁用獸藥。

目前已有應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法分別檢測(cè)動(dòng)物組織和牛奶中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的報(bào)道,但是飼料中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的測(cè)定方法還很少有報(bào)道，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)更是沒(méi)有。本試驗(yàn)應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中玉米赤霉醇及代謝物和己烯雌酚含量，為保證畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，有必要建立一種即靈敏又準(zhǔn)確的液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定飼料中非類(lèi)固醇同化激素含量，為食品安全和人們身體健康提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器Waters ACQUITY UPLC-TQ Detector超高效液相色譜儀、渦旋儀（Heros RS-2）、超聲儀（KQ-250DB）、高速離心機(jī)（Biofuge STRATOS Centrifuge）、MilliQ超純水器（美國(guó)Millipore公司），氮吹儀（ANPEL）。

1.1.2 對(duì)照品玉米赤霉醇（對(duì)照品來(lái)源為Dr.E公司）、玉米赤霉酮（對(duì)照品來(lái)源為witega公司）、己烯雌酚（對(duì)照品來(lái)源為Dr.E公司）。

1.1.3 對(duì)照品溶液的配制分別精密稱(chēng)取玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚3種對(duì)照品，以乙腈為溶劑配成濃度各約為 200 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，玉米赤霉酮和己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液2～8℃冷藏保存，玉米赤霉醇-20℃冷凍保存。準(zhǔn)確吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%乙腈水稀釋成濃度為50 ng/mL對(duì)照品上機(jī)液。

1.1.4 試劑甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）。試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 樣品前處理取2 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL的離心管中，加提取液（正己烷:乙酸乙酯溶液=85:15）20 mL，渦旋 15 s，室溫中超聲 20 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液10 mL于50 mL離心管中，40℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堄辔镉谜和槿芤?，備用?/p>

樣品備用液全部過(guò)經(jīng)10 mL正己烷活化的羥基凈化柱，5 mL正己烷淋洗，用真空泵抽干10 min，5 mL 50%乙腈水溶液洗脫，充分渦旋溶解后，過(guò)濾膜，灌瓶，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm（i.d.），粒徑1.8 μm），柱溫40℃，流動(dòng)相流速為0.3 mL/min，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient phase for UPLC

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧正離子掃描（ESI-），毛細(xì)管電壓3.0 KV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔錐孔氣流速50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，光電倍增管電壓650 V。采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式，母離子（Q1）/子離子（Q3）離子對(duì)及各組分保留時(shí)間見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 母離子和子離子的選擇以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用MS-Scan模式進(jìn)行全掃描，確定母離子質(zhì)量數(shù)，優(yōu)化母離子使其獲得較高的豐度。選定母離子后再采用Daughter-Scan方式對(duì)其子離子進(jìn)行掃描，通過(guò)優(yōu)化碰撞能量選擇兩個(gè)豐度較高的子離子作為定性和定量離子。3種目標(biāo)化合物的離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量的優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 質(zhì)譜測(cè)定和液相色譜優(yōu)化條件的選擇

表 2目標(biāo)化合物的UPLC-MS/MS檢測(cè)條件Table 2 UPLC-MS/MS acquisition parameters for target compounds

2.2.1 質(zhì)譜測(cè)定質(zhì)譜的毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度和流速、錐孔電壓、碰撞能量在兼顧所有目標(biāo)化合物都有良好的響應(yīng)信號(hào)情況下進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.2 液相色譜條件采用甲醇可以使具有相似保留特性的激素在反相色譜柱上有良好的保留，因此選用Waters HSS T3 100 mm色譜柱，以甲醇和水溶液作流動(dòng)相，在流速為0.3 mL/min的梯度條件下分3種藥物得到了良好的分離效果。3種藥物的保留時(shí)間參見(jiàn)表2。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化玉米赤霉醇以及代謝物與己烯雌酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)有很大的不同，故要求前處理方法必須兼顧3種目標(biāo)化合物都能得到很好的回收率，并且凈化基質(zhì)，減少干擾。飼料中檢測(cè)這3種目標(biāo)化合物的報(bào)道很少，查閱動(dòng)物組織和牛奶中對(duì)其的研究報(bào)道，不同文獻(xiàn)有所不同。經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)分析，對(duì)檢測(cè)飼料中的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 提取方法試驗(yàn)考察了正己烷、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯等不同有機(jī)試劑的提取效果，其中甲基叔丁基醚和正己烷-乙酸乙酯效果較好，進(jìn)一步比較了甲基叔丁基醚與不同比例的正己烷-乙酸乙酯（80:20、85:15、90:10、95:5）的提取效果，根據(jù)回收效果表明正己烷-乙酸乙酯（85:15）時(shí)提取效果最佳。

2.3.2 凈化方法固相萃取凈化柱選用Agilent Technologies的Bond Elut-2OH凈化柱。根據(jù)不同凈化柱的性能和凈化條件進(jìn)行比較試驗(yàn)。試驗(yàn)表明Bond Elut-2OH凈化柱與HLB反相凈化柱相比較具有較好的凈化效果，過(guò)程簡(jiǎn)單，活化和淋洗的試劑相同，回收穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾小。因此本研究選擇Bond Elut-2OH凈化柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜分析當(dāng)中是非常普遍存在的現(xiàn)象，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚受到樣品的基質(zhì)效應(yīng)因素影響，而這種效應(yīng)在液質(zhì)當(dāng)中有著抑制離子化過(guò)程的影響，從而導(dǎo)致了分析的準(zhǔn)確性，所以我們分別用50%乙腈和空白樣品溶液稀釋的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行LC-MS/MS對(duì)比來(lái)檢測(cè)，基質(zhì)效應(yīng)可以通過(guò)樣品基質(zhì)中待測(cè)物的峰面積與純?nèi)芤褐写郎y(cè)物峰面積的比值計(jì)算。結(jié)果表明3種目標(biāo)化合物在離子化的過(guò)程中有細(xì)微的信號(hào)減少，而在相應(yīng)的樣品檢測(cè)中，采用了空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)樣來(lái)抵消基質(zhì)效應(yīng)。不同的飼料基質(zhì)所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)大小都不一樣，所以在檢測(cè)時(shí)要測(cè)定不同的飼料，要選擇對(duì)應(yīng)的飼料基質(zhì)來(lái)配制基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液。

在本試驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)普遍存在。因此在日常的例行檢測(cè)中，最好能夠?qū)︼暳线M(jìn)行分類(lèi)檢測(cè)，即對(duì)每類(lèi)飼料做一個(gè)基質(zhì)標(biāo)樣，減少由于不同基質(zhì)從而產(chǎn)生的干擾，如果有可能采用強(qiáng)化添加的方式，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.5 線(xiàn)性方程、檢出限和定量限不同飼料樣品的組成比較復(fù)雜，其中含有大量的的蛋白質(zhì)、脂肪和鹽等干擾物，會(huì)對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性造成一定的影響，進(jìn)而影響試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。不同的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度造成的影響也不同，為了降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量準(zhǔn)確度的影響，本試驗(yàn)繪制基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)進(jìn)行定量。

分別精密量取適量玉米赤霉醇，玉米赤霉酮和己烯雌酚，制得濃度為2、5、10、20、50、100、200 ng/mL系列對(duì)照溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.6 方法的靈敏度

表3 目標(biāo)化合物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Calibration curves，correlation coefficient、LOD and LOQ of target compounds

2.6.1 空白試料 按相同的步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試料對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾。

2.6.2 檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ） 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白樣品中，經(jīng)提取凈化后測(cè)定，根據(jù)所測(cè)藥物的S/N＞3（按PtP算）計(jì)算3種藥物在玉米、DDGS、配合飼料、精料補(bǔ)充料中檢出限為10 μg/kg，S/N＞10計(jì)算3種藥物在玉米、DDGS、配合飼料、精料補(bǔ)充料中定量限20 μg/kg。10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在MRM監(jiān)測(cè)模式下的選擇離子流圖見(jiàn)圖1。

2.7 方法回收率和精密度考察在確定樣品預(yù)處理方法后，用各類(lèi)空白飼料樣品作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。配制10、20和50 μg/kg 3個(gè)濃度的試樣，每批次內(nèi)同一濃度做5次平行試驗(yàn)，平均回收率為61.7%～99.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜15%。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

圖1 MRM監(jiān)測(cè)模式下3標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子流圖（10 μg/L）Fig.1 Selected ion chromatogram of standards in MRM of target compounds

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)玉米、DDGS、配合飼料、精料補(bǔ)充料等飼料產(chǎn)品中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚，本方法簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。方法檢測(cè)限和定量限低，能滿(mǎn)足我國(guó)對(duì)飼料中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烯雌酚的監(jiān)測(cè)需要。

表4 方法的回收率及精密度（n=5）Table 4 Results of recovery experiments and RSD%

表5 方法的回收率及精密度（n=5）Table 5 Results of recovery experiments and RSD%

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