李延山，李欣南，韓鐫竹，高 鐸，武鳳嬌

（1.遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003；2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽110016）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）是革蘭氏陽性，過氧化氫陰性球菌，是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一[1]，占腸道菌群的82%～87%[2]，具有重要的生理功能。其能產(chǎn)生細菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環(huán)境[3]；還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量，使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降[4]。農(nóng)業(yè)部在2008年公布的第1126號公告《飼料添加劑品種目錄》中將其列為允許在飼料中添加的益生菌種類[5]。但在發(fā)揮作用的同時，糞

1.1 菌株來源糞腸球菌質(zhì)控菌株為ATCC29212，購自中國獸藥監(jiān)察所；豬肛門或雞泄殖腔棉拭子來源于肉雞和生豬養(yǎng)殖場（戶）。腸球菌也是一種條件致病菌[6]。在動物中，常見糞腸球菌引發(fā)狗的外耳炎[7]，家禽的敗血癥和心內(nèi)膜炎[8-9]及仔豬的關(guān)節(jié)炎和敗血癥[10]等。本文借鑒選擇分離、生化鑒定、藥物敏感性試驗等方法[11-12]，通過分析東北地區(qū)健康動物中糞腸球菌的耐藥性變化趨勢，為臨床糞腸球菌的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國NUAIRE公司）、全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團）、恒溫培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）、ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養(yǎng)基與材料運送培養(yǎng)基、腸球菌肉湯培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；API NaCl 0.85%培養(yǎng)基、rapid ID 32 STREP鑒定條均購自BIOMERIEUX公司；腸球菌藥敏檢測板購自天津市金章科技發(fā)展有限公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣用滅菌棉簽采集動物肛門和泄殖腔樣品，置入運送培養(yǎng)基中0～4℃保存。

1.4.2 分離純化將拭子樣品直接接入腸球菌肉湯中，36±1℃培養(yǎng)48 h。挑取預(yù)增菌培養(yǎng)物劃線接種于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基36±1℃培養(yǎng)48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36±1℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.3 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線純化培養(yǎng)不超過24 h。將待檢細菌單個菌落，懸浮于3 mL懸浮培養(yǎng)基，制備4.0麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，使用自動加樣器將菌懸液滴入試紙條反應(yīng)杯中，每個反應(yīng)杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養(yǎng)4小時，用細菌鑒定儀判讀。

1.4.4 藥物敏感性試驗用接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1～18小時的3～5個單菌落，用無菌生理鹽水稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?。取M-H肉湯稀釋至5×105CFU/mL濃度的菌液0.1 mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻，試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的一半。將加有菌液和抗菌藥物的板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h。取出培養(yǎng)后的板，觀察結(jié)果，以無菌生長的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。在質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，按判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷被檢菌株的敏感性—敏感（S），中度敏感（I）或耐藥（R），判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 分離純化結(jié)果采集了東北地區(qū)26個養(yǎng)殖場的豬肛門或雞泄殖腔棉拭子共780份樣品，分離鑒

2 結(jié)果與分析

定得到289株糞腸球菌，分離率為37.05%。在腸球菌肉湯中，培養(yǎng)后混濁變黑為疑似菌株，仍保持澄清透明、棕褐色為陰性，具體結(jié)果見圖1。

圖1 腸球菌肉湯中的生長情況Fig.1 The growth condition of Enterococcus broth

糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上帶棕色環(huán)的棕黑色菌落，邊緣光滑沒有白色潤圈的為疑似單菌落，白色菌落為其他菌株，結(jié)果見圖2。最終在哥倫比亞血瓊脂上菌落圓形、純白色，表面凸起濕潤，有光澤，邊緣整齊的菌落確定為陽性糞腸球菌，結(jié)果見圖3。

圖2 陽性糞腸球菌在糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上的生長形態(tài)Fig.2 The growth pattern of positive Enterococcus faecalis in the agar medium of Enterococcus faecalis

圖3 糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂上的生長狀態(tài)Fig.3 The growth state of Enterococcus faecalis on Columbia blood agar

2.2 鑒定結(jié)果經(jīng)細菌鑒定儀判讀后得到的糞腸球菌生化鑒定，與中國微生物菌種目錄給出的糞腸球菌一致。

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果

2.3.1 糞腸球菌的耐藥率和MIC分布根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，將最小抑菌濃度minimum inhibitory concentration，MIC）分布列于表1。

總體來說，糞腸球菌對13類測試抗生素普遍耐藥，豬源糞腸球菌和雞源糞腸球菌的耐藥狀況沒有明顯區(qū)別，均對截短側(cè)耳素類、頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類高度耐藥，對萬古霉素高度敏感。

豬源糞腸球菌對青霉素類、頭孢菌素類、磺胺異噁唑、截短側(cè)耳素類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥物耐藥率均大于90.0%；對氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類和氯霉素類耐藥率介于30.0%～80.0%之間，MIC也主要分布在耐藥的區(qū)域；對β-內(nèi)酰胺類復(fù)合物、唑烷酮類和萬古霉素相對敏感，耐藥率小于10.0%，多數(shù)菌株MIC仍然分布在敏感區(qū)域。

雞源糞腸球菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類、磺胺異噁唑、截短側(cè)耳素類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥物耐藥率均大于88.0%；對四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素類、復(fù)方新諾明耐藥率介于30.0%～70.0%之間，MIC也主要分布在耐藥的區(qū)域；對β-內(nèi)酰胺類和萬古霉素相對敏感，耐藥率小于10.0%，多數(shù)菌株MIC仍然分布在敏感區(qū)域。

表1 東北地區(qū)豬、雞源糞腸球菌耐藥率及MIC分布情況Table 1 The resistance rate of Enterococcus faecalis and MIC distribution of Pig and chicken source in Northeast China

表1 東北地區(qū)豬、雞源糞腸球菌耐藥率及MIC分布情況（續(xù)）

2.3.2 糞腸球菌的EUCAST分布 將得到的MIC分布結(jié)果與歐盟藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)（European Committee Antimicrobial Susceptibility Testing， EUCAST）進行比較，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，代表藥物MIC分布整體相對集中，變化不大，相對于EUCAST的MIC整體水平右移，MIC在增大，導(dǎo)致耐藥率增高。

2.3.3 多重耐藥性狀況 本文中的多重耐藥均是以藥物類別來進行統(tǒng)計分析?？傮w來看，不同動物來源的菌株多重耐藥率沒有明顯差異，4類及4類以上糞腸球菌耐藥菌株占98.61%；10類糞腸球菌耐藥株占1.73%，未見全部耐藥菌株（見圖5）。

圖4 東北地區(qū)豬、雞源腸球菌代表藥物的MIC分布圖Fig.4 The MIC distribution of Enterococcus drug representatives of Pig and chicken in Northeast China

圖5 東北地區(qū)豬、雞源腸球菌多重耐藥折線圖Fig.5 Multiple resistance line diagram of Enterococcus source of Pig and chicken in Northeast China

3 討論

本文對東北地區(qū)的動物源糞腸球菌進行了耐藥性監(jiān)測，藥敏試驗表明分離獲得的糞腸球菌對臨床常用的多種抗菌藥物有較高的耐藥率，耐藥率較高的幾種常見抗生素依次為頭孢菌素類、磺胺異噁唑、截短側(cè)耳素類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類藥。這幾類抗菌藥物中，一些耐藥性是天然耐藥，例如頭孢菌素類；一些是獲得性耐藥，例如磺胺類，說明該類抗菌素用藥壓力嚴(yán)重，若繼續(xù)使用不但增加治療預(yù)防成本，也會誘發(fā)耐藥性的進一步遷移，因此，臨床用藥應(yīng)參考耐藥性監(jiān)測結(jié)果進行合理調(diào)整，降低耐藥性的產(chǎn)生。

在我國，耐萬古霉素腸球菌感染的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，耐萬古霉素腸球菌是臨床重要病原菌之一，通過監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在東北地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素的糞腸球菌，應(yīng)持續(xù)監(jiān)測及時預(yù)警。

[1]Malik RK,Montecalvo MA,Reale MR,et a1.Epidemiology and contral of vancomycin-resistant enterococci in a regional neonatal intensive care unit.Pediatr Infect Dis J,1999,18(4):352．

[2]王建業(yè)，王永坤.益生菌必備條件及其功效評價[J].中國家禽，2002，24（2）：4-9.

[3]Dimov S G,Peykov S,Raykova D.A newly discovered bacteriocin produced byEnterococcus faecalis3915[J].Benef Microbes,2010,1(1):43-51.

[4]楊珍妮，劉丹，劉冰熔.腸道菌群與結(jié)直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究進展[J].世界華人消化雜志，2014，6：2547-2552.

[5]《農(nóng)業(yè)知識：科學(xué)養(yǎng)殖》記者.農(nóng)業(yè)部公布《飼料添加劑品種目錄（2008）》[J].農(nóng)業(yè)知識，2009（3）：5.

[6]王亞賓，陳麗穎，張紅英，等.仔豬感染糞腸球菌的病原鑒定及病原特性初報[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（5）：39-43.

[7]劉曉強，李引乾，張小鶯.氟喹諾酮類藥物對陜西境內(nèi)犬糞腸球菌的敏感性和防突變濃度[J].中國抗生素雜志，2014，39（2）：151-154.

[8]傅愛玲，索翠萍.從腹腔引流物中檢出一株母雞腸球菌[J].醫(yī)學(xué)檢驗與臨床，2007，18（6）：101.

[9]狄婷婷，高原，聶鑫，等.致鵝敗血癥糞腸球菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（3）：192-196.

[10]王亞賓，胡清林，陳麗穎，等.一株致仔豬關(guān)節(jié)炎糞腸球菌的鑒定[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（s1）：157-161.

[11]蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹.某養(yǎng)殖場雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014，4：48-50.

[12]韓鐫竹，李欣南，蘇葳藝，等.兩種糞腸球菌的分離方法比較[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015（1）：5-9.