蔡 楓，蔣麒俊，谷麗華，李 嵐

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 200071)

抗中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)抗體(ANCA)是一類以單核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及中性粒細(xì)胞為靶抗原的自身抗體，存在于眾多自身免疫性疾病及炎性疾病中[1]?？?髓過(guò)氧化物酶(MPO)和抗-蛋白酶3(PR3)是2種典型的ANCA，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)等疾病中具有較高的陽(yáng)性率[2]。然而，部分患者可表現(xiàn)為ANCA陽(yáng)性，抗-MPO和抗-PR3陰性，部分學(xué)者認(rèn)為該患者可能存在某些非典型ANCA。目前，關(guān)于非典型ANCA的研究較少，且缺乏臨床調(diào)查的研究數(shù)據(jù)[3]。本研究旨在探究非典型ANCA抗原譜與疾病的相關(guān)性，為臨床診斷及預(yù)后提供指導(dǎo)意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年12月至2016年9月本院門診及住院收治的自身免疫性疾病或炎性疾病患者1 963例，其中男191例、女1 772例，年齡10～87歲，中位年齡為45歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥10歲，男女不限；(2)符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重高血壓、糖尿病及重要器官功能不全等內(nèi)科慢性疾??；(2)合并神經(jīng)精神類疾病。疾病類型包括：1 128例SLE，386例干燥綜合征(SS)，296例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)，24例UC，39例皮肌炎(DM)，60例強(qiáng)直性脊椎炎(AS)及22例自身免疫性肝炎(AIH)。另取同期參加體檢的志愿者50例作為健康對(duì)照組，其中男20例，女30例，年齡35～65歲，中位年齡為50歲，均排除自身免疫性疾病或炎性疾病，且無(wú)自身免疫疾病家族史。2組一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 間接免疫熒光法(IIF)檢測(cè)試劑 采用粒細(xì)胞馬賽克檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)試驗(yàn)診斷有限公司)，試劑檢測(cè)區(qū)包括猴肝組織、人喉癌上皮細(xì)胞、甲醛固定的粒細(xì)胞及乙醇固定的中性粒細(xì)胞等4種生物薄片。

1.2.2 蛋白印跡(WB)檢測(cè)試劑 采用WB抗-MPO、抗-PR3和抗-腎小球基底膜(GBM)免疫球蛋白G(IgG)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于德國(guó)歐蒙公司)，試劑盒中平行放置抗原高度純化的檢測(cè)膜條。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑 本研究ANCA譜選取6種典型及非典型抗體，包括：抗-MPO、抗-PR3、抗-GBM、抗-LF，抗-人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HLE)、抗-組織蛋白酶G(CG)及抗-殺菌性/通透性增加蛋白(BPI)。微孔板ELISA檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于德國(guó)歐蒙公司)。

1.2.4 熒光顯微鏡 采用德國(guó)EUROStar Ⅱ型熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 IIF檢測(cè)ANCA 嚴(yán)格按照操作說(shuō)明，將研究對(duì)象血清1∶10稀釋后25 μL滴于生物薄片上，22～24 ℃環(huán)境下反應(yīng)20 min，在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液中浸泡2 min，加入兔抗人IgG，避光放置20 min，再用PBS緩沖液浸泡2 min，甘油封片。同樣方法加作陰性及陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照包括核周型ANCA(p-ANCA)和細(xì)胞質(zhì)型ANCA(c-ANCA)。

1.3.2 WB檢測(cè)ANCA 將血清1∶10稀釋后1.5 mL滴加于抗-MPO、抗-PR3和抗-GBM抗原高度純化的檢測(cè)膜條上，室溫下均勻搖蕩10 min，后用PBS緩沖液洗滌3次，加入同為1∶10稀釋的酶結(jié)合物1.5 mL，再次搖蕩、洗滌后加入底物溫育20 min，最后洗滌3次，待干燥后按照說(shuō)明書中的判定標(biāo)準(zhǔn)觀察結(jié)果。

1.3.3 ELISA檢測(cè)非典型ANCA 部分患者IIF檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，但抗-MPO及抗-PR3檢測(cè)結(jié)果為陰性。對(duì)此，部分患者血清采用ELISA進(jìn)行其他靶抗原的檢測(cè)，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書中的操作流程。

1.4 觀察指標(biāo) 記錄各疾病種類ANCA的陽(yáng)性率及靶抗原種類，比較典型ANCA與非典型ANCA患者的一般資料的差異，包括：性別比、年齡、疾病種類和病程。病程分為短期(初次就診且病程<12個(gè)月)和長(zhǎng)期(病程≥12個(gè)月)。

2 結(jié) 果

2.1 IIF和WB檢測(cè)結(jié)果 共361例患者檢測(cè)ANCA陽(yáng)性。各疾病按照陽(yáng)性率由高到低排列依次為SLE、UC、SS、RA和AS。樣本量較少的DM、AIH與健康對(duì)照組50例ANCA均為陰性。見(jiàn)表1。

表1 IIF和WB檢測(cè)結(jié)果

2.2 非典型ANCA檢測(cè)結(jié)果 ANCA檢測(cè)陽(yáng)性，而抗-MPO和抗-PR3檢測(cè)陰性共121例，應(yīng)用ELISA對(duì)其行非典型ANCA確認(rèn)試驗(yàn)，結(jié)果顯示其中24例抗-LF陽(yáng)性，3例抗-BPI陽(yáng)性，1例抗-彈性蛋白酶陽(yáng)性。

2.3 典型與非典型ANCA患者一般資料比較 收集330例典型ANCA與30例非典型ANCA患者的一般資料，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，2組在性別比、年齡、疾病種類和病程方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 典型與非典型ANCA患者一般資料比較

3 討 論

目前，關(guān)于非典型ANCA的研究較少，缺乏臨床調(diào)查的研究數(shù)據(jù)[5]。非抗-MPO、非抗-PR3的ANCA抗體相關(guān)疾病譜較復(fù)雜，可涉及風(fēng)濕免疫性疾病、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)和炎性腸病(CIBD)，尚不清楚ANCA抗體是否為小血管炎等疾病發(fā)病病因或是否僅為發(fā)病所伴發(fā)的現(xiàn)象或后果[6]。已知的非抗-MPO、非抗-PR3的ANCA抗體靶抗原有多種，其中既有細(xì)胞質(zhì)抗原，又有核抗原。靶抗原主要有乳鐵蛋白、組織蛋白G、彈性酶、溶菌酶、細(xì)菌通透性增加蛋白、過(guò)氧化氫酶、α-烯醇化酶、高遷移率族蛋白、組蛋白1、板層素B1等等[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，CIBD患者即使IIF檢測(cè)結(jié)果為陰性的血清標(biāo)本，也有一定比例的靶抗原檢出率[8]。因此，進(jìn)行非典型ANCA抗原譜與疾病的相關(guān)性研究對(duì)臨床診斷、病情活動(dòng)、療效及預(yù)后判斷等具有重要意義[9]。本研究選取1 963例確診為自身免疫性疾病和炎性疾病的患者，通過(guò)IIF、WB和ELISA等3種檢測(cè)手段，分析不同靶抗原的ANCA所對(duì)應(yīng)的疾病譜，旨在探究典型與非典型ANCA與疾病的相關(guān)性。

從本研究結(jié)果來(lái)看，共361例患者檢測(cè)ANCA陽(yáng)性。各疾病按照陽(yáng)性率由高到低排列依次為SLE、UC、SS、RA、AS，這與劉義慶等[10]的研究結(jié)果一致。樣本量較少的DM、AIH與健康對(duì)照組50例ANCA均為陰性。選取ANCA檢測(cè)陽(yáng)性，而抗-MPO和抗-PR3檢測(cè)陰性共121例，均為p-ANCA型，應(yīng)用ELISA對(duì)其行非典型ANCA確認(rèn)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，其中24例抗-LF陽(yáng)性，3例抗-BPI陽(yáng)性，1例抗-彈性蛋白酶陽(yáng)性。LF和BPI在機(jī)體免疫中發(fā)揮抗炎作用，筆者推測(cè)該特異性靶抗原可能參與了炎性反應(yīng)過(guò)程。典型與非典型ANCA患者在性別比、年齡、疾病種類和病程方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究在試驗(yàn)過(guò)程中存在一定技術(shù)上的難點(diǎn)，由于許多自身免疫性疾病患者血清中存在抗核抗體(ANA)，應(yīng)用IIF檢測(cè)ANCA時(shí)，ANA有時(shí)會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果，特別是熒光染色表現(xiàn)為均質(zhì)型的ANA，會(huì)進(jìn)一步增加結(jié)果判斷難度。因此，在篩選ANCA陽(yáng)性，抗-MPO和抗-PR3陰性患者時(shí)需要檢測(cè)人員具備良好的經(jīng)驗(yàn)。

本研究存在以下2點(diǎn)不足：(1)研究對(duì)象疾病種類受限，且某些疾病樣本量過(guò)小，導(dǎo)致其無(wú)ANCA陽(yáng)性患者，因此結(jié)果在一定程度上存在局限性；(2)目前已知的靶抗原種類較少，且受限于試驗(yàn)材料，仍有許多患者ANCA陽(yáng)性卻未找到相應(yīng)靶抗原，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，自身免疫性疾病或炎性疾病患者血清ANCA陽(yáng)性率較高，繼續(xù)采用ELISA進(jìn)行針對(duì)性篩查發(fā)現(xiàn)絕大部分靶抗原為抗-MPO和抗-PR3，少數(shù)患者存在抗-LF和抗-BPI等非典型ANCA。

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