朱 旭，鄭利平，楊 蘭，陸俊佳

(廣西醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院暨南寧市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科 530031)

胱抑素C(Cys-C)是一種廣泛存在于有核細(xì)胞和體液中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可調(diào)節(jié)特異性組織蛋白酶的活性，在動脈粥樣硬化(AS)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。Cys-C基因突變可導(dǎo)致Cys-C表達(dá)改變，而Cys-C基因位點(diǎn)及其頻率分布受人種、地域等因素影響較大。目前，國內(nèi)外關(guān)于Cys-C基因多態(tài)性與冠心病(CHD)的關(guān)系研究結(jié)果尚不一致。本研究通過檢測廣西壯族、漢族CHD患者外周血清中Cys-C水平及Cys-C基因位點(diǎn)+148 G/A、+73 A/G和-82 G/C基因多態(tài)型，以及不同基因多態(tài)性分布頻率，探討廣西壯族CHD與Cys-C水平及其3個(gè)基因位點(diǎn)關(guān)系，為CHD防治提供全新視角?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣西壯族自治區(qū)南寧市(壯族主要分布區(qū))的壯族CHD患者(壯族CHD組)、壯族健康志愿者(壯族健康組)、漢族CHD患者(漢族CHD組)和漢族健康志愿者(漢族健康組)各100例。壯族CHD組男54例、女46例，中位年齡為55.9歲；壯族健康組男53例、女47例，中位年齡為52.9歲；漢族CHD組男55例、女45例，中位年齡為58.3歲；漢族健康組男54例、女46例，中位年齡為54.4歲。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)3代以上皆與同民族通婚的壯族、漢族家族，選擇最后一代個(gè)體為研究對象，且其盡可能在家族可追蹤的歷史上沒有與其他民族通婚；(2)無其他急、慢性疾病史及遺傳性疾病家族史。CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)》。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性腦出血、腦梗死；所有感染，自身免疫性疾病，代謝性疾病(糖尿病除外)、腎臟疾病及使用激素；妊娠、腫瘤。采樣前遵循知情同意原則，告知研究對象并確保研究對象間無血緣關(guān)系。收集所有研究對象的臨床資料。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。4組研究對象性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 日立-7600全自動生化儀購于日本日立公司，ABI-9700擴(kuò)增儀購于美國ABI公司，電泳儀購于北京六一儀器廠，凝膠成像儀購于珠海黑馬生物公司；肌酐(Cr)、Cys-C試劑購于浙江伊利康生物技術(shù)有限公司，空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等試劑購于羅氏公司；DNA抽提試劑購于北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 獲取試驗(yàn)資料 抽取所有研究對象空腹靜脈血5 mL，分別注入乙二胺四乙酸二鉀鹽(EDTA-K2)抗凝管(2 mL)及干燥管(3 mL)?？鼓苌舷骂嵉箶?shù)次，充分混勻后，置于4 ℃冰箱短時(shí)(<7 d)保存，用于Cys-C基因3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性檢測。干燥管靜置30 min， 3 000 r/min離心10 min，分離血清用于測定FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Cr及Cys-C水平。

1.3.2 生化項(xiàng)目的檢測 全自動生化儀測定所有研究對象血清中FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C 、Cr和Cys-C水平。所有項(xiàng)目測試前，均做室內(nèi)質(zhì)控，室內(nèi)質(zhì)控在控后，才可進(jìn)行檢測。

1.3.3 DNA提取 采用離心吸附柱法提取全血DNA，一切操作嚴(yán)格按照試劑說明書操作，提取好的DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.4 Cys-C基因檢測 (1)引物序列和反應(yīng)體系：根據(jù)GenBank提供的 Cys-C基因啟動子序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。Cys-C基因+148、+73和-82位點(diǎn)引物序列，見表1。反應(yīng)體系共50 μL：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合反應(yīng)液8 μL(含dNTP、buffer)、Taq酶0.5 μL、DNA模版2 μL、上下游引物各1 μL和無菌水37.5 μL。

表1 Cys-C+148 G/A、+73 A/G和-82 G/C基因位點(diǎn)引物序列及內(nèi)切酶

(2)Cys-C+148、+73 和-82基因位點(diǎn)的擴(kuò)增條件及限制性片段長度多態(tài)性分析：94 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 1 min、62 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s、35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min 。限制性酶切反應(yīng)：PCR后產(chǎn)物20 μL、內(nèi)切酶1 μL，buffer 3μL，無菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣5 μL酶切后產(chǎn)物，電壓100 V，電泳30 min后凝膠圖象分析儀下觀察電泳結(jié)果，分析并攝像保存。Cys-C+148位點(diǎn)：產(chǎn)物為254 bp(A等位基因)，酶切后為132 bp和122 bp的2個(gè)片段(G等位基因)。Cys-C+73位點(diǎn)：產(chǎn)物為254 bp(A等位基因)，酶切后為63 bp和191 bp的2個(gè)片段(G等位基因)。Cys-C-82位點(diǎn)：產(chǎn)物長度為379 bp(C等位基因)，酶切后為200 bp和179 bp的2個(gè)片段(G等位基因)。

2 結(jié) 果

2.1 4組臨床資料及Cys-C水平比較 4組間臨床資料和Cys-C水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。壯族、漢族CHD組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、FPG、收縮壓、舒張壓、TG、TC、LDL-C、Cys-C、Cr水平明顯高于同民族健康組，而HDL-C明顯低于同民族健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。壯族、漢族CHD組FPG、BMI、收縮壓、舒張壓、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Cys-C及Cr水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組臨床資料及Cys-C水平比較

注：與同民族健康組比較，*P<0.05

2.2 CHD組血清Cys-C水平與CHD其他危險(xiǎn)因素的相關(guān)性 2個(gè)CHD組患者血清中Cys-C水平與CHD危險(xiǎn)因素中的FPG、BMI、收縮壓、舒張壓、TG、TC、HDL-C、LDL-C無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但與Cr水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

2.3 4組Cys-C基因分型結(jié)果 4組Cys-C+148、+73和-82基因位點(diǎn)的主要型別是野生型，壯族、漢族CHD組中Cys-C+148、+73基因雜合程度高于同民族健康組，而Cys-C-82基因位點(diǎn)雜合程度低于同民族健康組。經(jīng)H-W平衡檢驗(yàn)，4組的Cys-C+148、+73和-82基因位點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合H-W群體遺傳平衡法則，具有群體代表性。比較4組Cys-C+148、+73和-82不同基因型頻率，Cys-C+73等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Cys-C+148和-82等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。壯族、漢族CHD組的Cys-C+73G基因型分布頻率均高于同民族健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。漢族CHD組Cys-C+73位點(diǎn)G基因型分布頻率與壯族CHD組不同，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。電泳結(jié)果見圖1。

表3 Cys-C與CHD其他危險(xiǎn)因素Spearman相關(guān)分析

表4 4組研究對象Cys-C的基因檢測結(jié)果

2.4 CHD患者Cys-C+148、+73 A/G和-82 G/C基因型與血清Cys-C水平的關(guān)系 兩民族所有CHD患者Cys-C+73位點(diǎn)不同基因型間血清Cys-C水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GG基因型患者Cys-C水平明顯低于AG型和AA型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AG型與AA型間Cys-C水平比較差異無有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。壯族、漢族CHD組患者Cys-C+73位點(diǎn)同一基因型間Cys-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CHD患者Cys-C+148和-82位點(diǎn)不同基因型間血清Cys-C水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 CHD患者Cys-C+73和-82不同基因型的血清 Cys-C水平

續(xù)表5 CHD患者Cys-C+73和-82不同基因型的血清 Cys-C水平

注：與同組GG基因型血清Cys-C水平比較，#P<0.05

注：23、24、26分別為Cys-C+73 GG、AG、AA基因型；27、28、29分別為Cys-C-82 GG、GC、CC基因型；30、31、32分別為Cys-C+148 GG、GA、AA基因型

圖1 Cys-C+148 G/A、+73 A/G和-82 G/C電泳圖

3 討 論

Cys-C表達(dá)于所有有核細(xì)胞，參與機(jī)體眾多生理和病理過程。除了可作為評價(jià)腎小球?yàn)V過功能的重要指標(biāo)外[1]，Cys-C還通過與半胱氨酸抑素酶(如組織蛋白酶等)形成緊密的復(fù)合物，從而抑制半胱氨酸抑素酶的活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解的動態(tài)平衡。同時(shí)，Cys-C可影響粒細(xì)胞的吞噬及趨化作用，參與AS的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，Cys-C水平與CHD的發(fā)生有密切關(guān)系。Cys-C水平降低時(shí)，其抑制半胱氨酸蛋白酶功能——尤其是組織蛋白酶的抑制功能下降，從而導(dǎo)致組織蛋白酶活性增強(qiáng)，造成病理性損傷，加速CHD的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。 Cys-C編碼基因位于染色體20p11.2，是胱抑素超家族中的成員。前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，Cys-C基因發(fā)生突變可能引起機(jī)體Cys-C的合成和分泌水平減少，導(dǎo)致Cys-C酶活性的抑制功能減弱，引起機(jī)體生理、病理發(fā)生改變。Cys-C基因主要在基因啟動子處發(fā)生突變，且其基因突變及分布頻率受種族、地域影響。目前，國內(nèi)外研究對Cys-C水平及基因多態(tài)性與CHD關(guān)系的結(jié)論尚不一致[4-6]。

本研究中，壯族、漢族CHD組血糖、血脂、血壓和腎功能等指標(biāo)較同民族健康組有明顯差異，進(jìn)一步證明了血糖、血脂、血壓和腎功能等是CHD的危險(xiǎn)因素。壯族、漢族CHD組外周循環(huán)中Cys-C水平明顯高于同民族健康組，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果相似[7-8]，但與低水平Cys-C可促進(jìn)AS發(fā)生、發(fā)展的結(jié)論相悖。壯族、漢族CHD組患者外周循環(huán)Cys-C水平高于同民族健康組，分析原因可能與CHD患者存在腎功能不全有關(guān)。本研究中壯族、漢族CHD組Cr水平高于同民族健康組，且Cys-C水平與Cr水平呈正相關(guān)。Cr水平升高時(shí)Cys-C測定結(jié)果亦升高，提示腎功能受損導(dǎo)致CHD患者外周循環(huán)中Cys-C水平升高。不過，本研究僅檢測了CHD患者血清中的Cys-C水平，未檢測動脈粥樣硬化局部組織的Cys-C表達(dá)水平，不能判定局部血管組織Cys-C水平情況。

Cys-C+73位點(diǎn)A/G突變，可導(dǎo)致蘇氨酸替換信號肽倒數(shù)第2位的丙氨酸。而Cys-C+148位點(diǎn)G/A突變卻導(dǎo)致2-信號肽由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼幔@些氨基酸的替換可影響Cys-C向高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輸運(yùn)，通過中斷信號肽、影響成熟蛋白的斷裂等方式來修飾Cys-C的加工途徑，導(dǎo)致Cys-C分泌減少或活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，壯族、漢族CHD組Cys-C+73位點(diǎn)AG和GG基因型分布頻率明顯高于同民族健康組。進(jìn)一步分析Cys-C+73不同基因型外周循環(huán)中Cys-C水平，發(fā)現(xiàn)G等位基因外周血中Cys-C水平降低，特別是GG基因型患者Cys-C水平明顯降低。壯族、漢族CHD組患者Cys-C+73位點(diǎn)相同基因型外周循環(huán)中的Cys-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示Cys-C+73基因多態(tài)性導(dǎo)致的低水平Cys-C是廣西壯族自治區(qū)壯族、漢族CHD患者的危險(xiǎn)因素。CHD患者及健康人群Cys-C+148和-82位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析原因可能是：(1)Cys-C+148和-82位點(diǎn)基因多態(tài)性不是廣西壯族自治區(qū)的CHD候選基因位點(diǎn)，這與郭進(jìn)京等[9]研究甘肅省CHD患者Cys-C基因多態(tài)性的結(jié)論相一致，但與國外研究結(jié)論不一致[10]；(2)Cys-C+148位點(diǎn)的A基因型和-82位點(diǎn)G基因型可能廣西壯族自治區(qū)的壯族、漢族CHD發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素，但因本研究觀察的樣本量僅為100例，加之納入研究的個(gè)體可能存在選擇誤差，群體代表性還不夠強(qiáng)，具有局限性，不足以檢測出相關(guān)性。

綜上所述，Cys-C+73位點(diǎn)基因多態(tài)性所致的低水平Cys-C可能是廣西壯族自治區(qū)壯族、漢族CHD患者的易感因素，但腎功能不全引起的血清高Cys-C水平掩蓋了上述現(xiàn)象。Cys-C+73基

因多態(tài)性與CHD的關(guān)系還需進(jìn)一步對局部組織進(jìn)行研究。

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