張蕓蕓 丁進(jìn) 華宏軍 季峰 滕衛(wèi)軍?

浙江省是胃癌高發(fā)地區(qū)之一，盡管目前胃癌發(fā)病和死亡有下降趨勢(shì)［1-2］，但胃癌患者確診時(shí)多已處于晚期，5年生存率＜20%［2］，研究顯示人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）過度表達(dá)在致瘤轉(zhuǎn)化和胃癌的發(fā)生中起關(guān)鍵作用［3］?，F(xiàn)有的HER-2單抗雖然能夠有效抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但腫瘤耐藥現(xiàn)象仍然存在［4］，而HER-2核酸適配子經(jīng)體外篩選，具有成本低，不引起機(jī)體免疫反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，已在腫瘤基礎(chǔ)研究領(lǐng)域得到應(yīng)用，并已證實(shí)其對(duì)多種腫瘤具有抑制作用［3］。通過指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)篩選出HER-2核酸適配子可以有效靶向殺傷胃癌細(xì)胞［5］。本文探討HER-2核酸適配子對(duì)胃癌的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料 用于SELEX篩選的DNA隨機(jī)文庫(kù)由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。文庫(kù)兩端為固定序列，中間為40個(gè)堿基的隨機(jī)序列。PCR擴(kuò)增所用的引物由Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，上游引物5'標(biāo)記nTc熒光標(biāo)記。引物序列：上游引物（BI）序列：5'-FrI'CACcGACCGTGC'rGCACTCT-3'。下游引物（B2）序列：5'-CGCAACGCTCGCTCATAcT-3'。人胃癌細(xì)胞細(xì)胞株NCI-N87細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。無(wú)血清培養(yǎng)基keratinocyte-SFM、1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；Dulbeeeo78磷酸鹽緩沖液，酵母tR-NA購(gòu)自Sigma公司。洗滌緩沖液（含4.5g/L葡萄糖及5mMMgCl2的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液），結(jié)合緩沖液（含有0.1mg/ml酵母tRNA和lmg/ml BSA的洗滌緩沖液）。

1.2 篩選HER-2的核酸適配子庫(kù) 適配子篩選參照Dastjerdi KD的方法［6］采用SELEX技術(shù)。采用合作單位實(shí)驗(yàn)室已有的人cDNA文庫(kù)為模板的基礎(chǔ)上合成并建立隨機(jī)ssDNA的文庫(kù)，隨機(jī)片段為40bp左右，總長(zhǎng)為80bp～100bp。隨機(jī)ssDNA文庫(kù)、HER-2蛋白稀釋液和selex binding buffer混勻后于37℃孵育40min；混合液濾過0.22μm的硝酸纖維素膜；selex washing buffer洗滌5次，去除非特異性結(jié)合的ssDNA；抽真空后加入selex eluting buffer于80℃作用10min，洗脫下與HER-2結(jié)合的ssDNA，經(jīng)酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化后，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：模板2μl，10×PCR緩沖液10μl，MgCl26μl，dNTPs 100μmol/L，Taq酶2U，上游引物50pmol，下游引物1pmol，加去離子水至100μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性40s，最佳退火溫度退火30s，72℃延伸45s。循環(huán)次數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。最后72℃延伸7min。核酸回收純化后建立次級(jí)文庫(kù)，并以此進(jìn)行第二輪的篩選，直至完成10輪左右的篩選。最后擴(kuò)增所得的文庫(kù)為后續(xù)研究的核酸適配子。

1.3 核酸適配子的鑒定 適配子的克隆、測(cè)序：經(jīng)10輪左右的篩選得到的ssDNA，對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增為dsDNA，經(jīng)回收試劑盒純化回收后與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定后隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行親和性測(cè)定，選擇親和性高的適配子進(jìn)行測(cè)序。親和性測(cè)定：（1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87胃癌細(xì)胞HER-2的親和力（以熒光標(biāo)記的適配子為探針）。數(shù)值表示法 mean fluorescence intensity（MFI）：（ 適 配 子 濃 度μM）陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度，適配子的熒光強(qiáng)度。（2）ELISA檢測(cè)不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，將NCI-N87全蛋白裂解液1μg/ml包被96酶標(biāo)孔板后，加不同濃度的生物素標(biāo)記的HER-2適配子反應(yīng)，最后用鏈霉親和素-HRP酶復(fù)合物和TMB底物液顯色，450nm吸光值高低代表HER-2適配子的結(jié)合水平及反應(yīng)強(qiáng)度。（3）IPWesternblot免疫共沉淀法檢測(cè)不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，在1.5ml管子中加入：NCI-N87全蛋白裂解液250μg，不同濃度（0～100μM）的生物素標(biāo)記的HER-2適配子，親和素標(biāo)記的agarose瓊脂糖，用PBS補(bǔ)足1ml，4°冰箱旋轉(zhuǎn)反應(yīng)過夜。次日，反應(yīng)液經(jīng)離心洗滌后，沉淀物進(jìn)行蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜，用抗HER-2抗體進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。條帶深淺即表示HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的結(jié)合量和結(jié)合力。

1.4 體外研究HER-2核酸適配子對(duì)高表達(dá)HER-2胃癌細(xì)胞的抑瘤活性 HER-2表達(dá)干預(yù)模型的建立：采用分子生物學(xué)技術(shù)，分別構(gòu)建具有高效轉(zhuǎn)染和表達(dá)特征的重組腺病毒Ad-HER-2（表達(dá)外源性HER-2的重組腺病毒）和Ad-HER-2-siRNA（特異性HER-2基因表達(dá)沉默的siRNA重組腺病毒）。將重組腺病毒分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SCG7901，經(jīng)Western-blot及定量RT-PCR技術(shù)鑒定，建立過表達(dá)HER-2的胃癌細(xì)胞系SCG7901（轉(zhuǎn)染Ad-HER-2），及HER-2表達(dá)抑制的胃癌細(xì)胞系NCI-N87（轉(zhuǎn)染Ad-HER-2-siRNA），用于以下實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞于含10%小牛血清（FBS）和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置95%空氣濕度、5%CO2和37℃環(huán)境中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT）：將各腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞播種于96孔板。不同濃度的HER-2核酸適配子或稀釋劑加入到樣本中，細(xì)胞經(jīng)37℃/CO2培養(yǎng)，用MTT法測(cè)定存活細(xì)胞的百分率，通過微孔讀數(shù)器測(cè)570nm吸光度來決定存活細(xì)胞數(shù)量；用定量ELISA測(cè)定DNA合成期所結(jié)合的溴脫氧尿苷（BrdU）量來檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況；96孔板中，加NCI-N87細(xì)胞2000個(gè)/孔，24h后加入不同濃度（0～100μM）的適配子，1次/隔2d換新鮮培養(yǎng)液，加藥后第6天用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V Assay檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡與增殖情況，以此篩選出具有高抗瘤活性的HER-2核酸適配子用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究HER-2核酸適配子對(duì)高表達(dá)HER-2胃癌細(xì)胞的抗瘤活性 Balb/C裸鼠，皮下荷瘤NCI-N87細(xì)胞5X10E6個(gè)/只（n=3），荷瘤4d后，腹腔注射HER-2適配子40μg/（次·只），1次/周，共6次。同步同法以抗HER-2抗體［160μg/（次·只）］治療作對(duì)照。末次注射后1周處死，剝離瘤體測(cè)量腫瘤大小，稱重。腫瘤體積按照公式：長(zhǎng)度×（寬度）2×0.5。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER-2核酸適配子的篩選及鑒定 篩選獲得的胃癌細(xì)胞HER-2核酸適配子為：共86個(gè)核苷酸的序列5'-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATT TTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACT ACACACGCACA-3'。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87胃癌細(xì)胞HER-2的親和力，結(jié)果顯示10μM HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有較好的反應(yīng)。ELISA檢測(cè)不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，結(jié)果顯示：0、0.1、1.0、10、100μM HER-2適配子濃度時(shí)的 A450nm 值分別為 0.08、0.17、0.54、1.68、2.27，可見10μM HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有較好的反應(yīng)。IP-Westernblot免疫共沉淀法檢測(cè)不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的親和力，結(jié)果顯示：10μM HER-2適配子對(duì)NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有較好的親和反應(yīng)。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)分析HER-2核酸適配子在胃癌中的抗瘤活性 細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTS）結(jié)果顯示：與抗HER-2抗體比較，10μM HER-2適配子對(duì)NCI-N87細(xì)胞增殖活力具有顯著的抑制作用（見表1）。Annexin-V PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度（0～100μM）HER-2適配子誘導(dǎo)NCI-N87胃癌細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：0μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM的凋亡陽(yáng)性率分別為（2.94±0.37）、（4.21±0.43）、（10.46±0.56）、（33.39±0.63）、（44.69±0.60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=512.38，P＜0.01）；與抗HER-2抗體的凋亡陽(yáng)性率（20.39±0.55）比較，10μM HER-2適配子能顯著誘導(dǎo)NCI-N87細(xì)胞的凋亡（χ2=24.24，P＜0.01）。

表1 不同濃度HER-2適配子對(duì)NCI-N87細(xì)胞增殖活力的抑制作用

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析HER-2核酸適配子在胃癌中的抗瘤活性 18例Balb/C裸鼠腫瘤模型建立后，隨機(jī)分為HER-2適配子治療組、抗HER-2抗體治療組及未治療組，每組各6只。結(jié)果顯示，三組腫瘤重量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=111.65，P＜0.01）；進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)兩兩比較，HER-2適配子治療組、抗HER-2抗體治療組及未治療組的腫瘤重量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.05、1.95、2.99，P＜0.05），即 HER-2適配子治療組＜抗HER-2抗體治療組＜未治療組（見表2）。

表2 各組腫瘤大小與腫瘤比較

3 討論

HER-2核酸適配子是一種人工合成的兩端短的固定序列，具有較多連抗體均無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)［6］：（1）適配子可以結(jié)合大分子如蛋白質(zhì)和細(xì)胞，還可以結(jié)合小分子如核苷酸，氨基酸甚至金屬離子，而抗體只能識(shí)別相對(duì)較大的能夠引起免疫反應(yīng)的分子。（2）適配子是體外篩選，篩選范圍大，且不受生理環(huán)境的約束（如高低溫或高低pH值環(huán)境等），而抗體無(wú)法做到。（3）適配子可以通過化學(xué)合成的方式迅速得到，生產(chǎn)成本較低；抗體制備周期約為3～6個(gè)月，成本高。（4）適配子可以根據(jù)目的不同而進(jìn)行修飾，抗體不能實(shí)現(xiàn)。（5）適配子分子小，不會(huì)引起機(jī)體免疫反應(yīng)。

目前，核酸適配子在腫瘤研究領(lǐng)域取得一定成果，但有關(guān)適配子在胃癌方面的證據(jù)依然不足。Meza-Junco J等［7］發(fā)現(xiàn)22%～28%胃癌細(xì)胞中存在HER-2過度表達(dá)，而HER-2過表達(dá)與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。新近Balogh Z等認(rèn)為核酸適配子完全可與單抗媲美［8］，Archemix公司生產(chǎn)的AS1411是第一個(gè)進(jìn)入I期及II期臨床試驗(yàn)的核酸適配子，并已得到證實(shí)，其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株（如急性髓系白血病和腎癌細(xì)胞）具有抑制作用，且療效良好［9］。張宇等［10］證實(shí)應(yīng)用HER能夠有效抑制HER-2高表達(dá)胃癌細(xì)胞的作用。進(jìn)而，西妥昔單抗可有效抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但其耐藥依然存在而影響效果［11］，而核酸適配子對(duì)紫杉醇耐藥肺腺癌有效［12］。

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